間斑寇蛛毒素的蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究新進(jìn)展

王賢純，梁宋平

間斑寇蛛毒素的蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究新進(jìn)展

王賢純，梁宋平

湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410081

間斑寇蛛Latrodectus tr edecimguttatus俗稱“黑寡婦”蜘蛛。其毒素不僅存在于毒腺中，而且存在于其身體的其他部分、卵粒甚至新生幼蛛體內(nèi)。研究間斑寇蛛毒腺和毒腺外材料中的毒素成分，探明它們之間的異同、進(jìn)化關(guān)系和生物學(xué)作用，具有重要的理論和實(shí)際意義?，F(xiàn)代蛋白質(zhì)化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為間斑寇蛛蛋白質(zhì)和多肽毒素的研究提供了有效手段，從而可以同時(shí)從單一純化蛋白質(zhì)和組學(xué)的層面探究毒素作用的分子基礎(chǔ)和作用機(jī)制。到目前為止，間斑寇蛛毒素的蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究已取得一定的進(jìn)展，但相關(guān)研究尤其是毒腺外材料來源的毒素研究還有待進(jìn)一步深入。

毒素，蛋白質(zhì)，多肽，間斑寇蛛，進(jìn)展

間斑寇蛛Latrodectus tr edecimguttatus俗稱“黑寡婦”蜘蛛，屬于節(jié)肢動(dòng)物門，蛛形綱，蜘蛛目，球蛛科。國外主要分布于地中海沿岸各國，在國內(nèi)主要分布于新疆、云南、內(nèi)蒙古、甘肅等地[1-2]。間斑寇蛛是目前世界上已知毒性最強(qiáng)的蛛種之一，經(jīng)常給人、畜造成傷害，甚至導(dǎo)致死亡[2-4]。2000–2002年，我國新疆的哈密、奇臺(tái)、青河、庫爾勒等地出現(xiàn)間斑寇蛛的大爆發(fā)，發(fā)生多起間斑寇蛛傷害人、畜的事件，引起當(dāng)?shù)卣兔襟w的關(guān)注[5-6]。間斑寇蛛毒腺分泌的毒液的毒性主要由其蛋白質(zhì)成分所致[7-8]。已證明其毒液中包含幾種分子量較大的寇蛛屬蜘蛛代表性蛋白質(zhì)毒素-latrotoxins (LTX)。它們選擇性作用于脊椎動(dòng)物、昆蟲和甲殼類動(dòng)物等不同類型的動(dòng)物。在過去幾十年里，從寇蛛屬蜘蛛毒液中至少分離出了7種不同的latrotoxins。它們都是分子量范圍在110–130 kDa的酸性蛋白質(zhì)，pI范圍為5.0–6.0。其中大多數(shù)以昆蟲 (蜘蛛的天然獵物) 為作用對(duì)象。其中，有關(guān)α-latrotoxin的研究最為深入[9-11]。Latrotoxins被廣泛用于研究脊椎動(dòng)物、昆蟲和甲殼類動(dòng)物神經(jīng)分泌的分子機(jī)制。Latrotoxins特別是α-latrotoxin的結(jié)構(gòu)和功能分析中取得的進(jìn)展從根本上加深了我們對(duì)這些毒素復(fù)雜作用機(jī)制的了解并使我們獲得了關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)節(jié)機(jī)制的重要信息。Ushkaryov等[11-12]和Rohou等[13]對(duì)此進(jìn)行了綜述。本文將著重概述間斑寇蛛毒素蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究的最新進(jìn)展。

1 毒腺毒液的蛋白質(zhì)組成及其與毒腺毒性的關(guān)系

與虎紋捕鳥蛛Selenocosmia huwena[14]等許多其他有毒動(dòng)物不同，間斑寇蛛毒腺分泌的毒液的毒性成分主要是蛋白質(zhì)[7-8]。分析鑒定毒液的蛋白質(zhì)組成有助于揭示毒液毒性的分子基礎(chǔ)和作用機(jī)制?，F(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用為蜘蛛毒素蛋白的分析鑒定提供了有利條件,尤其是高靈敏度生物質(zhì)譜儀的應(yīng)用使微量毒素樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析成為可能。

間斑寇蛛體型較小，毒素的采集不易，樣品來源不足是深入開展相關(guān)研究的瓶頸之一。寇蛛毒素研究中，解剖分離蜘蛛毒囊后提取毒素是早期研究常用的方法[15-17]，因該方法操作簡(jiǎn)單，可一次性將毒囊中的毒素全部取出。此外，在室內(nèi)人工飼養(yǎng)條件下，間斑寇蛛成年蜘蛛平時(shí)有一定比例的個(gè)體陸續(xù)死亡，且一般都會(huì)在越冬前死去，在成蛛死亡前及時(shí)分離其毒腺提取毒素可最大限度地利用毒素資源。為了擴(kuò)大毒素來源，筆者所在的研究室進(jìn)行了間斑寇蛛的室內(nèi)人工飼養(yǎng)研究，對(duì)影響間斑寇蛛室內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的因素如溫度、濕度和飼料成分等進(jìn)行了較為系統(tǒng)地探索，使間斑寇蛛的室內(nèi)飼養(yǎng)獲得成功并對(duì)采毒方法進(jìn)行了探討[18-19]。采用分離毒囊提取毒素的方式獲得了間斑寇蛛的毒腺毒素樣品，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性[20]和蛋白質(zhì)組學(xué)分析[21]。進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析時(shí)，鑒于樣品蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜性，采用了綜合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)策略，以利用不同策略鑒定結(jié)果的互補(bǔ)性，獲得覆蓋率和準(zhǔn)確性更高的鑒定結(jié)果。采用的技術(shù)策略主要包括SDS/PAGEMS/MS、2D-PAGE-MS/MS和Shotgun-MS/MS。在利用Shotgun-MS/MS策略時(shí)，液-質(zhì)聯(lián)用分析前對(duì)shotgun方法消化的樣品進(jìn)行了分級(jí)分離，以降低樣品的復(fù)雜程度，提高蛋白質(zhì)的鑒定效果。此外，為提高蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性，對(duì)采用未解析MS/MS數(shù)據(jù)檢索獲得的部分鑒定結(jié)果再次采用序列檢索法進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。通過跨庫檢索，共從樣品中鑒定出86個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。鑒定的蛋白質(zhì)中，除了文獻(xiàn)已報(bào)道的幾種代表性寇蛛毒素Latrotoxins外，還鑒定出其他多種酶類和特異蛋白質(zhì)，如溶菌酶、蛋白酶、磷酯酶和抑制蛋白等，推測(cè)這些蛋白質(zhì)也在間斑寇蛛粗毒的毒性中起重要的作用，因?yàn)橹┲氪侄镜哪承┟割愑绕涫堑鞍酌敢驯粚?shí)驗(yàn)證明參與毒素的毒性作用[22-23]。

利用解剖分離蜘蛛毒腺提取毒素的方法雖然簡(jiǎn)單易行，但不可避免地使樣品遭受部分組織蛋白的污染，同時(shí)也不利于重復(fù)利用寶貴的蜘蛛毒素資源。利用電刺激活體采毒法從蜘蛛毒腺采集毒液則可避免這些不足，不僅可以獲得沒有污染因而更具代表性的純凈毒液，而且每隔10–15天便可重復(fù)采毒一次，從而可最大限度地利用寶貴的毒素資源[18]。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過系列探索，建立了適用于間斑寇蛛活體采毒的電刺激采毒法，并用前述類似的方法對(duì)電刺激法采集的毒液進(jìn)行了生理生化[8]和蛋白質(zhì)組學(xué)分析[24]。結(jié)果顯示，毒液中的蛋白質(zhì)主要分布在分子量60 kDa以上和43 kDa左右的范圍，豐度最高的蛋白質(zhì)分布在100 kDa 左右。從中鑒定出122種非冗余蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明，其中75種蛋白質(zhì)具有明確的生物學(xué)功能；47種為預(yù)測(cè)或假定的蛋白質(zhì)或功能完全未知的蛋白質(zhì)。在鑒定的122種蛋白質(zhì)中，10種蛋白質(zhì) (占8.2%) 為文獻(xiàn)報(bào)道過的寇蛛毒素或其前體分子；13種 (占10.7%) 具有水解酶活性，包括蛋白酶和磷脂酶等，另有20種蛋白質(zhì) (占16.4%) 具有加單氧酶等其他酶活性，說明間斑寇蛛毒液富含代謝酶類；23種鑒定蛋白質(zhì) (占18.9%) 具有結(jié)合功能，它們能與其他蛋白質(zhì)、核酸或ATP 等結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，提示這些蛋白質(zhì)具有功能上的多樣性。具有其他功能的蛋白質(zhì)31種 (占25.4%)，包括結(jié)構(gòu)蛋白、離子通道蛋白和酶抑制劑等；有25種蛋白質(zhì)的功能完全未知，數(shù)據(jù)庫中缺乏相關(guān)信息，有待進(jìn)一步深入研究。值得一提的是，采用綜合蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略，從間斑寇蛛毒液中鑒定到幾乎所有文獻(xiàn)報(bào)道的代表性寇蛛毒素，說明采用綜合性組學(xué)分析策略獲得的鑒定結(jié)果具有較高的可靠性。

鑒于不同方法采集的毒素樣品組成上存在差別，Duan等[25]對(duì)電刺激方法采集的粗毒與用傳統(tǒng)的解剖毒腺的方法采集的粗毒進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，兩種方法獲得的粗毒樣品中的蛋白質(zhì)成分主要都是分子量較大(＞10 kDa)的酸性蛋白，分子量＜10 kDa的蛋白質(zhì)和多肽較少。與解剖毒囊的粗毒相比，電刺激粗毒含有較少的大分子量 (＞10 kDa) 蛋白質(zhì)，而分子量較小 (＜10 kDa) 的蛋白質(zhì)和多肽的組成非常相似，且主要分布在6–8 kDa的范圍內(nèi)。腹腔注射昆明種小白鼠后，兩種方法采集的粗毒引起的中毒癥狀相同。電刺激粗毒和毒囊粗毒的LD50分別為0.16 mg/kg和0.39 mg/kg。粗毒的哺乳動(dòng)物神經(jīng)毒性主要基于其中的大分子量酸性蛋白成分而不是低分子量的多肽?？偟恼f來，電刺激粗毒中的活性成分與毒囊粗毒中的相似，但含量高于毒囊粗毒。

2 毒腺轉(zhuǎn)錄組分析鑒定毒液的蛋白質(zhì)組成

盡管間斑寇蛛的毒腺毒素已得到了較為廣泛的研究，但由于有關(guān)基因組和轉(zhuǎn)錄組的資料有限，從而限制了我們對(duì)毒腺毒液分子組成的深入了解。He等[26]綜合利用第二代測(cè)序技術(shù)和傳統(tǒng)的cDNA文庫測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了間斑寇蛛毒腺的轉(zhuǎn)錄組，分別從34 334個(gè)從頭測(cè)定序列和1 024個(gè)cDNA序列中鑒定了9 666 個(gè)和480個(gè)高置信度的蛋白質(zhì)。對(duì)這些蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行深入分析后發(fā)現(xiàn)，毒腺富含與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和剪接、蛋白質(zhì)翻譯、加工和運(yùn)輸有關(guān)的mRNA分子，該特性是與毒腺產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素這一特殊功能一致的?？偣茶b定到146個(gè)毒素樣蛋白質(zhì)包括6種已知的代表性寇蛛毒素蛋白，可分成12家族，包括6個(gè)新家族，其中α-LTX-Lt1a家族2首次被鑒定為α-LTX-Lt1a家族的亞家族。根據(jù)其生物學(xué)活性可將鑒定的這些毒素蛋白分成能以協(xié)同方式發(fā)揮作用的5組：神經(jīng)毒素、輔助毒素、蛋白酶、蛋白酶抑制劑和功能未知的毒素。神經(jīng)毒素作為蜘蛛主要的武器特異性作用于神經(jīng)系統(tǒng)，殺死獵物或使之癱瘓；輔助毒素通過促進(jìn)神經(jīng)毒素與靶標(biāo)的結(jié)合而增強(qiáng)神經(jīng)毒素的作用；蛋白酶抑制劑可保護(hù)神經(jīng)毒素和輔助毒素免遭蛋白酶降解；蛋白酶能裂解毒素前體使之成為有活性的成熟毒素，或幫助消化和利用獵物。未鑒定到離子通道，提示蜘蛛不表達(dá)毒素的作用靶標(biāo)可能是蜘蛛免受自身毒素攻擊的一種可能的自我保護(hù)機(jī)制。該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫是目前最大的蜘蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組或毒素組數(shù)據(jù)庫，它使我們加深了對(duì)間斑寇蛛毒腺毒液蛋白質(zhì)組成復(fù)雜性及其產(chǎn)生和作用方式等的了解。

3 毒腺外蛋白質(zhì)類毒素的分析鑒定

與其他有毒動(dòng)物不同，間斑寇蛛的有毒成分不僅存在于毒腺中，而且還存在于身體的其他部位如腿和腹部組織，甚至卵粒和幼株體內(nèi)也存在毒性成分[27-28]。研究間斑寇蛛毒腺外材料中的毒素成分，探討其與毒腺毒素的異同和生物學(xué)作用等具有重要的理論和實(shí)際意義，不僅可以幫助我們了解相關(guān)的毒性機(jī)制，而且能夠擴(kuò)大蜘蛛毒素的研究領(lǐng)域，為毒素資源的開發(fā)利用篩選新的前體分子。

間斑寇蛛雌蛛大約在每年6月至10月間編織卵囊產(chǎn)卵。卵囊為黃褐色，卵囊內(nèi)卵粒呈黃色[29]。卵粒中為什么產(chǎn)生毒素，其與毒腺毒素的可能關(guān)系和異同等都是十分有趣的問題。我們的分析結(jié)果表明，卵粒富含高分子量的蛋白質(zhì)和分子量5 kDa以下的多肽，5 kDa至10 kDa的蛋白質(zhì)和多肽較少。蛋白質(zhì)分布在較寬的分子量和等電點(diǎn)范圍內(nèi)，說明卵粒的蛋白質(zhì)組成具有較高的復(fù)雜性。卵粒提取物能完全阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本內(nèi)的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，提示卵粒含有多種神經(jīng)毒性成分，且這種阻斷作用被證明主要由卵粒中的高分子量蛋白質(zhì)所致。酶學(xué)分析證明間斑寇蛛卵粒顯示多種水解酶活性，包括透明質(zhì)酸酶、乙酰膽堿酯酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、蛋白水解酶等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，卵粒中多種神經(jīng)毒性成分和其他活性成分的存在構(gòu)成了卵粒毒性的分子基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步探究卵粒蛋白與卵粒毒性作用的可能關(guān)系及其與間斑寇蛛毒腺毒素的關(guān)系與異同，Li等[30]綜合運(yùn)用基于凝膠電泳和shotgun分析的蛋白質(zhì)組學(xué)策略，對(duì)卵粒蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析鑒定和生物信息學(xué)分析，并與間斑寇蛛的毒腺毒液蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較。SDS-PAGE分析顯示間斑寇蛛卵粒蛋白主要分布在分子量大于60 kDa以及34 kDa附近的區(qū)域，在170 kDa附近具有較多的高豐度蛋白質(zhì)。通過CapLC-MS/MS分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索從卵粒提取物中共鑒定到157個(gè)非冗余蛋白。生物信息學(xué)分析表明，這些卵粒蛋白參與許多重要的細(xì)胞功能和代謝過程，包括催化作用、轉(zhuǎn)運(yùn)作用、新陳代謝調(diào)控等。其中，63個(gè)蛋白質(zhì) (約40.1%) 具有酶活性，包括蛋白酶、磷脂酶、磷酸酶、核酸酶和其他代謝酶類，說明卵粒富含酶類蛋白質(zhì)。44個(gè)蛋白質(zhì) (約占28.0%) 具有結(jié)合功能。它們能與ATP、核酸、蛋白質(zhì)/受體、脂類和/或金屬離子等結(jié)合，提示它們?cè)诙喾N物質(zhì)和能量代謝過程中起重要作用。其他一些鑒定的蛋白質(zhì)起著轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)和結(jié)構(gòu)分子活性的作用。此外還鑒定到14種功能未知的蛋白質(zhì)。通過比較發(fā)現(xiàn)，卵粒的蛋白質(zhì)組成比毒腺毒液的蛋白質(zhì)組成更為復(fù)雜，它們之間的相似性很小。與毒腺毒液蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果相比，從卵粒中鑒定到更多的酶和具有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)，但沒有從卵粒中鑒定到寇蛛毒腺毒液中的典型寇蛛毒素蛋白latrotoxins和其他已知的毒液蛋白類毒素成分，說明卵粒具有與毒腺毒液不同的蛋白質(zhì)組成和獨(dú)特的毒性機(jī)制。此外，鑒于間斑寇蛛卵粒反復(fù)勻漿和水提取后剩余的沉淀主要是卵粒的細(xì)胞膜，它們是構(gòu)成間斑寇蛛卵粒不可缺少的重要組成部分，Li[31]還運(yùn)用去垢劑輔助的方法對(duì)卵粒膜蛋白進(jìn)行了提取、SDS-PAGE分離和基于液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。SDS-PAGE分析表明，卵殼膜蛋白主要分布在34 kDa附近以及60 kDa以上的區(qū)域，與卵?？扇苄缘鞍椎姆植枷啾龋褮つさ鞍字饕植荚诟叻肿恿繀^(qū)域，30 kDa以下區(qū)域的蛋白質(zhì)條帶較少。從卵殼提取物中共鑒定到26個(gè)蛋白質(zhì)，包括多種酶和具有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明，多數(shù)鑒定的蛋白質(zhì)都是推斷的或功能未知的蛋白，提示間斑寇蛛的卵粒殼膜蛋白的組成和性質(zhì)具有其特殊性。

為了更為詳細(xì)地研究間斑寇蛛卵粒中的活性蛋白，我們?cè)谘芯恐芯C合運(yùn)用多種生物化學(xué)技術(shù)對(duì)卵粒中的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)與性質(zhì)分析。Li等[32-33]利用分子篩層析、離子交換層析以及反相高效液相色譜層析相結(jié)合的方法從卵粒提取物中分離純化出兩種活性蛋白，分別命名為L(zhǎng)atroeggtoxin-Ⅰ和Latroeggtoxin-Ⅱ。電噴霧質(zhì)譜測(cè)定它們的分子量分別為23.752 kDa和28.690 kDa。腹腔注射時(shí)Latroeggtoxin-Ⅰ能使小鼠產(chǎn)生一系列中毒癥狀。電生理實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白質(zhì)能以可逆的方式完全阻斷離體小鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，提示該蛋白具有較強(qiáng)的哺乳動(dòng)物毒性。Edman降解法測(cè)得該蛋白質(zhì)N-末端序列為N-S-I-A-D-D-R-Y-R-W-P-G-Y-P-G-A-G-L-I-P-YI-I-D-S—。Latroeggtoxin-Ⅱ的N-末端序列為E-S-I-Q-T-S-T-Y-V-P-N-T-P-N-Q-K-F-D-Y-E-V-GK-D-Y—。將Latroeggtoxin-Ⅱ通過腹腔注射小鼠和蜚蠊，可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特別是蜚蠊顯示一系列中毒癥狀，包括精神萎靡、運(yùn)動(dòng)遲緩和對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等。膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Latroeggtoxin-Ⅱ能特異性抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的TTX-R型Na+離子通道，抑制作用具有劑量效應(yīng)，而對(duì)TTX-S型Na+通道無明顯作用。鑒于背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)的TTX-R型鈉通道(即Nav1.8和Nav1.9) 在疼痛信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用，Latroeggtoxin-Ⅱ與TTX-R型鈉通道的相互作用可能改變疼痛傳入神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而改變外周疼痛感受，從而在疼痛研究及相關(guān)藥物的研發(fā)中顯示一定的應(yīng)用前景。利用測(cè)得的N-端序列運(yùn)用Mascot序列搜尋引擎搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的結(jié)果表明，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中沒有與Latroeggtoxin-Ⅰ和-Ⅱ匹配的蛋白質(zhì)。同時(shí)，BLAST分析也沒有發(fā)現(xiàn)完全相同的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果證明，這兩種蛋白質(zhì)都是首次從間斑寇蛛卵粒中分離純化出的新型毒性蛋白。

間斑寇蛛一般以幼蛛或卵粒的形式在卵囊中越冬。很早的時(shí)候就發(fā)現(xiàn)間斑寇蛛幼蛛體內(nèi)亦存在毒性成分[27-28]。為了探究幼蛛毒性的分子基礎(chǔ)及其與卵粒和毒腺毒性的關(guān)系，Peng等[34]對(duì)新生幼蛛的提取物進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生理生化分析并將其與卵粒提取物進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，幼蛛提取物的蛋白質(zhì)含量為69.42%，高于卵粒提取物。腹腔注射可引起小鼠和蜚蠊明顯的中毒癥狀乃至死亡，對(duì)小鼠的LD50值為5.30 mg/kg，說明幼蛛的毒性低于卵粒。電生理實(shí)驗(yàn)顯示，幼蛛提取物能夠完全阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本內(nèi)的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，提示幼蛛體內(nèi)含有多種哺乳動(dòng)物神經(jīng)毒活性成分。全細(xì)胞膜片鉗分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，幼蛛提取物能有效抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電壓門控Na+、K+和Ca2+通道電流，說明幼蛛含有豐富的能作用于神經(jīng)細(xì)胞離子通道的活性成分。凝膠電泳顯示，間斑寇蛛幼蛛的蛋白質(zhì)組成與卵粒的非常相似，主要差異表現(xiàn)在低豐度蛋白質(zhì)不同，提示幼蛛的毒性機(jī)制與卵粒的相似而與毒腺的具有較大差異；同時(shí)也說明新生幼蛛保留了大多數(shù)卵粒蛋白，低豐度蛋白質(zhì) (包括原有的和新合成的)在卵粒發(fā)育成幼蛛的過程中起重要作用。此外，還對(duì)幼蛛的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了初步分析，一次性鑒定到36個(gè)非冗余蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和與催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)加工、免疫等功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。另鑒定到一些功能未知的蛋白質(zhì)。

4 結(jié)論與展望

間斑寇蛛是一種較為奇特的蜘蛛，不僅因?yàn)樗鞘澜缟夏壳耙阎拘宰顝?qiáng)的蜘蛛之一，而且因?yàn)樗c一般的有毒動(dòng)物不同，不僅毒腺中合成和分泌毒素，而且其身體的其他組織器官甚至其幼蛛和卵粒中也產(chǎn)生毒性成分。研究這些毒性成分及其他活性成分的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和可能的相互關(guān)系及生物進(jìn)化上的意義，不僅可以拓展我們對(duì)蜘蛛毒素的了解，而且可以為開發(fā)醫(yī)藥、高效生物殺蟲劑及神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)研究的工具試劑篩選新型先導(dǎo)分子。到目前為止，盡管已對(duì)間斑寇蛛蛋白質(zhì)類毒素進(jìn)行了一些研究，并分離純化出多種蛋白質(zhì)和多肽毒素并對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了分析與鑒定，甚至有一些latrotoxins已被成功開發(fā)成工具試劑并在神經(jīng)生物學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，但總的來看，由于缺乏專門的蜘蛛基因組數(shù)據(jù)庫，從而給蜘蛛蛋白質(zhì)類毒素的分析鑒定帶來一定的困難；間斑寇蛛毒素尤其是毒腺外材料來源毒素的研究還有待進(jìn)一步深入，需要在數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建和蛋白質(zhì)類毒性成分的分離純化及結(jié)構(gòu)與功能研究方面加大投入。此外，鑒于天然毒素來源有限，必須加強(qiáng)活性蛋白類成分的分子生物學(xué)表達(dá)研究，以獲得足夠的樣品供詳細(xì)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及開發(fā)應(yīng)用研究之用。

REFERENCES

[1] Zhu MS. The spiders of China Arachnida Araneae Theridiidae. Beijing: Science Press, 1998: 293–294 (in Chinese).朱明生編著. 中國動(dòng)物志·蛛形綱·蜘蛛目·球蛛科. 北京: 科學(xué)出版社, 1998, 293–294.

[2] Bonnet MS. The toxicology of Latrodectus tredecimguttatus: the Mediterranean black widow spider. Homeopathy, 2004, 93: 27–33.

[3] Afshari R, Khadem-Rezaiyan M, Balali-Mood M. Spider bite (latrodectism) in Mashhad, Iran. Hum Exp Toxicol, 2009, 28(11): 697–702.

[4] Calista D, Venturelli C, Morri M. Latrodectus tredecimguttatus spider bite. Br J Dermatol, 2004, 151(2): 505.

[5] Lu DL, Zhang DF. Two varieties of highly poisonous spiders in Xinjiang and the prevention and cure of their bite. Chin J Zool, 2001, 36(5): 40–42 (in Chinese).陸東林, 張丹鳳. 新疆兩種劇毒蜘蛛及其咬傷防治. 動(dòng)物學(xué)雜志, 2001, 36(5): 40–42.

[6] Lian LH,Wang GH. First aid and nunersing for 14 cases of black spider bites, J Chin Prac Med, 2001, 2001, 3(15): 86 (in Chinese).連立紅, 王桂花. 14例黑蜘蛛蟄傷急救與護(hù)理.中華實(shí)用醫(yī)學(xué), 2001, 3(15): 86.

[7] Tu AT. Spider venoms. In. Tu AT(ed) Venoms: Chemistry and Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons Press, 1977: 484–500.

[8] Wang XC, Duan ZG, Yang J, et al. Physiological and biochemical analysis of L. tr edecimguttatus venom collected by electrical stimulation. J Physiol Biochem, 2007, 63(3): 221–230.

[9] Garb JE, Hayashi CY. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol Biol Evol, 2013, 30(5): 999–1014.

[10] Mesngon M, McNutt P. Alpha-latrotoxin rescues SNAP-25 from BoNT/A-mediated proteolysis in embryonic stem cell-derived neurons. Toxins (Basel), 2011, 3(5): 489–503.

[11] Ushkaryov YA, Rohou A, Sugita S. α-Latrotoxin and its receptors. Hardb Exp Pharmacol, 2008, 184: 171–206.

[12] Ushkaryov YA, Volynski KE, Ashton AC. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon, 2004, 43: 527–542.

[13] Rohou A, Nield J, Ushkaryov YA. Insecticidal toxins from black widow spider venom. Toxicon, 2007, 49(4/5): 531–549.

[14] Liang S. An overview of peptide toxins from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena Wang [=Ornithoctonus huwena (Wang)]. Toxicon, 2004, 43(43): 575–585.

[15] Frontali N, Ceccarelli B, Gorio A, et al. Purification from black widow spider venom of a protein factor causing the depletion of synaptic vesicles at neuromuscular junctions. J Cell Biol, 1976, 68(3): 462–479.

[16] Gorio A, Mauro A. Reversibility and mode of action of black widow spider venom on the vertebrate neuromuscular junction. J Gen Physiol, 1979, 73(2): 245–263.

[17] Misler S, Hurlbut WP. Action of black widow spider venom on quantized release of acetylcholine at the frog neuromuscular junction: dependence upon external Mg2+. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76(2): 991–995.

[18] Zhou H, He XZ, Duan ZG, et al. On methods for indoor rearing L. tredecimguttatus and collecting venom from the live spider. Acta Arachnol Sin, 2005, 14(1): 58–63 (in Chinese).周紅, 何小珍, 段志貴, 等. 間斑寇蛛 (L. tredecimguttatus) 室內(nèi)飼養(yǎng)及活體采毒方法的初步探討. 蛛形學(xué)報(bào), 2005, 14(1): 58–63.

[19] Duan ZG, Yan XJ, Deng XC, et al. Overwintering and early rearing of Latrodectus tredecimguttatusbaby spiders. Chin J Ecol, 2007, 26(3): 363–367 (in Chinese).段志貴, 晏曉軍, 鄧星燦, 等. 間斑寇蛛幼蛛過冬及其早期飼養(yǎng)管理. 生態(tài)學(xué)雜志, 2007, 26(3): 363–367.

[20] Yang J, Duan ZG, Zhou H, et al. Biological characterization of venom from spider Latrodectus tredecimguttatus. Acta Zool Sin, 2007, 53(4): 682–688 (in Chinese).楊靜, 段志貴, 周紅, 等. 間斑寇蛛粗毒的生物學(xué)特性. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2007, 53(4): 682–688.

[21] Duan ZG, Yan XJ, He XZ, et al. Extraction and protein component analysis of venom from the dissected venom glands of Latrodectus tredecimguttatus. Comp Biochem Physiol, Part B, 2006, 145(3/4): 350–357.

[22] Futrell JM. Loxoscelism. Am J Med Sci, 1992, 304: 261–267.

[23] Rash LD, Hodgson WC. Pharmacology and biochemistry of spider venoms. Toxicon, 2002, 40: 225–254.

[24] Duan ZG, Yan XJ, Cao R, et al. Proteomic analysis of Latrodectus tredecimguttatus venom for uncovering potential latrodectism-related proteins. J Biochem Mol Toxicol, 2008, 22(5): 328–336.

[25] Duan ZG, Yang J, Yan XJ, et al. Venom properties of the spider Latrodectus t redecimguttatus and comparison of two venom-collecting methods. Zool Res, 2009, 30(4): 381–388 (in Chinese).段志貴, 楊靜, 晏曉軍, 等. 間斑寇蛛粗毒液的生理生化分析及兩種采毒方法的比較. 動(dòng)物學(xué)研究, 2009, 30(4): 381–388.

[26] He QZ, Duan ZG, Yu Y, et al. The venom gland transcriptome of La trodectus tr edecimguttatus revealed by deep sequencing and cDNA library analysis. PLoS ONE, 2013, 8(11): e81357.

[27] Kobert R. Ueber die giftigen spinnen russlads. Sber Naturf Ges Dorpot, 1889, 8: 340–362.

[28] Akhunov AA, Golubenko Z, Abdurashidova NA, et al. Comparative biochemistry of the physiologically active components of venom, hemolymphy, and eggs of the karakurt spider (Latrodectus tredecimguttatus). Chem Nat Compd, 2001, 37(6): 562–565.

[29] Levy G. Fauna Palaestina. Arachnida Ⅲ-Araneae: Theridiidae. Jerusalem: Graphit Press, 1998: 85–97.

[30] Li J, Liu H, Duan Z, et al. Protein compositional analysis of the eggs of black widow spider (L. tredecimguttatus): implications for the understanding of egg toxicity. J Biochem Mol Toxicol, 2012, 26(12): 510–515.

[31] Li JJ. Biochemical research on proteins from the eggs of the spider L. tredecimguttatus[D]. Changsha: Hunan Normal University, 2013 (in Chinese).李建軍. 間斑寇蛛卵粒蛋白的生物化學(xué)研究[D].長(zhǎng)沙: 湖南師范大學(xué), 2013.

[32] Li JJ, Yan YZ, Wang JR, et al. Purif i cation and partial characterization of a novel neurotoxic protein from eggs of black widow spiders (Latrodectus t redecimguttatus). J Biochem Mol Toxicol, 2013, 27(7): 337–342.

[33] LI JJ, Yan YZ, Yu H, et al. Isolation and identification of a sodium channel-inhibiting protein from eggs of black widow spiders. Int J Biol Macromol, 2014, 65: 115–120.

[34] Peng XZ, Zhang YY, Liu JY, et al. Physiological and biochemical analysis to reveal the molecular basis for black widow spiderling toxicity. J Biochem Mol Toxicol, 2014, 28(5): 198–205.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Recent progress in protein chemistry and proteomics of Latrodectus tredecimguttatus toxins

Xianchun Wang, and Songping Liang
Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of Ministry of Edu cation, College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China

Latrodectus tredecimguttatus (commonly known as black widow spiders) have toxins not only in their venom glands, but also in other parts of their body, in their eggs and even in the newborn spiderlings. The study on the toxins invenom and materials outside the venom glands of the spiders to elucidate their differences and similarities, evolutional relationship and biological functions is of important theoretical and applicable significance. The development of modern protein chemistry and proteomics techniques has provided efficient means for the study of protein and peptide toxins of L. tredecimguttatus. By using such techniques, the molecular base and action mechanism of the toxins can be revealed at the levels of both single purified proteins and omics. Up to now, although protein chemistry and proteomics study on L. tredecimguttatus toxins have achieved a certain progress, the relevant work particularly that on the toxins in the materials outside the venom glands has to be further deepened.

toxin, protein, peptide, Latrodectus tredecimguttatu, progress

February 27, 2014; Accepted: June 3, 2014

Xianchun Wang. Tel: +86-731-88872556; E-mail: wang_xianchun@263.net

王賢純, 梁宋平. 間斑寇蛛毒素的蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究新進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(7): 1036?1043.

Wang XC, Liang SP. Recent progress in protein chemistry and proteomics of Latrodectus tredecimguttatus toxins. Chin J Biotech, 2014, 30(7): 1036?1043.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31070700, 31271135), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB529800), Cooperative Innovation Center of Engineering and New Products for Developmental Biology of Hunan Province (No. 20134486).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31070700, 31271135)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2010CB529800)，湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心經(jīng)費(fèi) (No. 20134486)資助。

時(shí)間：2014-06-27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140118.html