急性機(jī)械性脊髓損傷動(dòng)物模型研究進(jìn)展

劉海峰,王斌*,趙斌*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科,太原 030001; 2. 骨與軟組織損傷修復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001)

急性脊髓損傷是由于外傷、腫瘤、血腫及感染等原因所致的脊髓受壓[1],可導(dǎo)致完全或不完全的感覺運(yùn)動(dòng)能力的喪失,合并有較高的死亡率[2]。 目前我國脊髓損傷年患病率為13 ～60 人次/100 萬,并且有逐年增高的趨勢(shì),其原因多為高處墜落、交通事故等[3]。 利用動(dòng)物模型可以更好地模擬臨床中的急性機(jī)械性脊髓損傷,如急性鈍挫傷模型的建立主要是為了研究神經(jīng)保護(hù)治療后的創(chuàng)傷后損傷過程和修復(fù)過程[4];脊髓橫斷/半橫斷動(dòng)物模型可用來觀察脊髓損傷后神經(jīng)纖維及軸突的再生情況;鉗夾及壓迫傷模型可以反映損傷和壓迫程度的關(guān)系以尋求手術(shù)減壓時(shí)間窗。 現(xiàn)筆者就急性機(jī)械性脊髓損傷模型的研究進(jìn)展綜述如下。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

1.1 大鼠

大鼠具有易獲取、種系內(nèi)純合度高、再生能力與抗感染能力強(qiáng)、管理飼養(yǎng)方便、行為學(xué)評(píng)估方法成熟、損傷后在電生理及病理學(xué)改變上與人類相似等優(yōu)勢(shì)[5],成為建立急性脊髓損傷模型最常用的動(dòng)物。 但大鼠在解剖結(jié)構(gòu)上與人類有所差異,其皮質(zhì)脊髓束幾乎都位于背側(cè),而人類的皮質(zhì)脊髓束則位于后外側(cè)白質(zhì)部分。 同時(shí),皮質(zhì)脊髓束的損傷會(huì)對(duì)人類的運(yùn)動(dòng)功能造成比較嚴(yán)重的影響[6],而在大鼠模型中卻不明顯,反而其他的脊髓傳導(dǎo)通路,如紅核脊髓束以及5-羥色胺通路的損傷會(huì)對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能造成較大影響[7]。 在基因研究領(lǐng)域,雖然轉(zhuǎn)基因大鼠在近年來取得了一定的發(fā)展,仍無法替代小鼠在該領(lǐng)域的應(yīng)用[8]。

1.2 小鼠

小鼠多在基因工程中使用[9],其遺傳背景較為明確,體內(nèi)微生物可比較穩(wěn)定地控制、性狀遺傳穩(wěn)定,通常用來觀察相關(guān)基因及其表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)于脊髓損傷的作用。 但小鼠體形小,不易于手術(shù)操作,術(shù)后由于細(xì)胞增生形成纖維化瘢痕連接脊髓損傷的兩側(cè)斷端[10],與人或是大鼠中形成充滿液體的囊腔樣改變或者空洞樣改變不同,有研究表明在脊髓完全橫斷的情況下小鼠的脊髓會(huì)有一定程度的再生[11],而在人或者大鼠中則沒有這樣的表現(xiàn)。

綜上所述,鼠類動(dòng)物往往僅應(yīng)用于脊髓損傷初步研究,盡管已有部分研究在鼠類模型中取得一定結(jié)果,但仍需進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化于大型動(dòng)物模型中來確保安全性及有效性。

1.3 大、中型哺乳動(dòng)物

包括兔、犬、豬、貓、山羊等動(dòng)物,它們體型較大,容易操作。 這類動(dòng)物在解剖特征上與人類較為相似,可應(yīng)用于測(cè)試新療法的潛在療效,以確?？捎糜谂R床。 其中兔常用作脊髓缺血損傷模型的建立,其血管結(jié)構(gòu)比較簡單,從腹主動(dòng)脈尾側(cè)到腎動(dòng)脈起源之間很少有分支血管,僅阻斷腹主動(dòng)脈便可以有效地造成脊髓的缺血損傷[12],該模型不足之處在于大多數(shù)抗體來源為兔來源,限制了對(duì)于該模型的檢測(cè)[13]。 犬類除了在解剖結(jié)構(gòu)與人類相似之外,一定程度也會(huì)同人類一樣會(huì)受到自發(fā)性疾病的影響,例如肌營養(yǎng)不良、腫瘤、脊髓損傷等[14]。 值得注意的是,犬類動(dòng)物胸段椎間盤的突出可能是導(dǎo)致其脊髓自發(fā)性損傷的主要原因[15],因此犬類常作為研究椎間盤壓迫導(dǎo)致脊髓損傷的動(dòng)物模型[16]。 貓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)較為發(fā)達(dá),常被用來研究脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞之間的相互聯(lián)系[17],且貓的脊髓平均長度(34 cm)與人的脊髓長度(平均40 ～45 cm)較為接近,使其在評(píng)估脊髓再生潛能方面具有一定優(yōu)勢(shì)[18]。 豬也可用于脊髓損傷模型的制作,其miRNA表達(dá)譜與大鼠相比更接近于人類,其中已知的有45%的序列與人類同源,而在大鼠中只有16%,使得豬成為研究脊髓損傷后轉(zhuǎn)錄水平變化的理想模型[19]。 山羊的脊椎、脊髓結(jié)構(gòu)與人類相似,其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究在電生理學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得進(jìn)展,且山羊容易進(jìn)行行為學(xué)功能的訓(xùn)練以及損傷功能恢復(fù)的觀察[20]。 但出于較高的飼養(yǎng)費(fèi)用、嚴(yán)格的監(jiān)管要求以及倫理方面的考慮,并沒有廣泛地應(yīng)用于急性脊髓損傷的造模中。

1.4 非人靈長類動(dòng)物

非人靈長類動(dòng)物的脊髓組織與人類最接近[21]。Friedli 等[22]人發(fā)現(xiàn)靈長類動(dòng)物的下行皮質(zhì)脊髓束包括來自雙側(cè)的軸突,在脊髓半切損傷模型中未損傷側(cè)的軸突可以代償性地長入對(duì)側(cè)損傷平面以下的部分從而促進(jìn)雙側(cè)脊髓功能的恢復(fù),而大鼠脊髓損傷模型中卻沒有這樣的表現(xiàn),這個(gè)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了靈長類動(dòng)物在物種間研究及治療脊髓損傷的研究起到了重要的作用。 同樣由于飼養(yǎng)費(fèi)用較高、倫理要求嚴(yán)格等,也沒有廣泛地應(yīng)用于急性脊髓損傷的造模中。

1.5 其他種類動(dòng)物(爪蟾等)

爪蟾用于脊髓損傷模型的建立有以下優(yōu)勢(shì)：(1)爪蟾的受精卵體積大約是大鼠的2300 倍,只需將體外構(gòu)建的基因改造工具微注射到卵子或受精胚胎中便能夠方便地在脊髓發(fā)育成熟前進(jìn)行基因工程的改造;(2)由于受精卵是透明的,在胚胎發(fā)育階段可以直接看到脊髓發(fā)生的變化;(3)其脊髓結(jié)構(gòu)比較簡單,容易進(jìn)行組織及細(xì)胞間的分析;(4)其脊髓再生潛能十分巨大,容易尋找促進(jìn)再生的因素[23]。 且爪蟾擁有獨(dú)特的再生能力常被用來研究新型的治療策略,但由于其屬于非哺乳類動(dòng)物,研究所取得的結(jié)果有待進(jìn)一步的證實(shí)。

2 損傷節(jié)段的選擇

臨床中脊髓損傷中最為常見的節(jié)段是頸段,然而動(dòng)物模型常選擇胸腰段進(jìn)行造模。 原因可能包括以下幾點(diǎn)：(1)脊髓的灰質(zhì)損傷會(huì)導(dǎo)致較難辨認(rèn)的功能喪失,而白質(zhì)不同于灰質(zhì),選擇胸段進(jìn)行造?？梢暂^好地選擇損傷白質(zhì),對(duì)于功能的恢復(fù)比較容易觀察;(2)造模時(shí)損傷節(jié)段越高,傷后越易出現(xiàn)呼吸、心血管等系統(tǒng)并發(fā)癥,死亡率越高。 頸段的脊髓損傷容易導(dǎo)致呼吸功能的受損,這可能是在頸段進(jìn)行造模時(shí)容易切斷膈運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元導(dǎo)致膈肌受損進(jìn)而造成呼吸功能受限有關(guān)[24];(3)胸腰段脊髓處椎板咬除較方便,能夠降低操作難度和避開骶髓排便中樞[24];(4)在頸段只能進(jìn)行單側(cè)半切損傷模型或者脊髓挫傷的建立,因?yàn)轭i髓完全橫斷損傷會(huì)造成嚴(yán)重的四肢癱瘓以及較高的死亡率,這樣的做法在倫理方面是不允許的。

3 急性機(jī)械性脊髓損傷模型的用途

3.1 急性挫傷模型

在臨床中大多數(shù)的脊髓損傷是由外傷導(dǎo)致脊髓受壓或挫傷造成的,因此為了研究脊髓損傷后的病理生理變化,首選挫傷和/或壓迫模型。 Allen 首次采用垂直打擊顯露硬脊膜致急性脊髓挫傷的方法,此法簡單易行,制作成本低,易于復(fù)制,但是打擊的精準(zhǔn)度難以保持一致,后人不斷對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)[25]。 目前常用的包括以下幾種打擊器：紐約大學(xué)打擊器(New York University (NYU) impactor)[26]、水平打擊器(infinite horizon (IH) impactor)[27]、俄亥俄州立大學(xué)打擊器(Ohio State University (OSU)impactor)[28]、空氣打擊器(air gun impactor)[29]。 除此之外,還有許多研究者不斷研發(fā)新型打擊器和改進(jìn)部分配件,如：打擊頭、椎體固定裝置等,其目的都是為了盡可能模擬臨床中常見脊髓損傷以及減少不必要的副損傷。

Squair 等[30]建立胸3 節(jié)段嚴(yán)重脊髓挫傷模型來研究米諾環(huán)素對(duì)于交感興奮性神經(jīng)的保護(hù)作用、減輕自主神經(jīng)功能障礙以及其對(duì)于脊髓損傷后血流動(dòng)力學(xué)的調(diào)控。 Hara 等[31]發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變?cè)谛∈蠹顾璐靷Ｐ椭袑?duì)于膠質(zhì)瘢痕的形成具有重要的調(diào)控作用,并通過蛋白組學(xué)等方法尋找在這個(gè)過程的主要調(diào)控分子對(duì)其進(jìn)行干擾以觀察小鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)指標(biāo)以及膠質(zhì)瘢痕的形成情況。 大多數(shù)研究對(duì)于脊髓損傷過程血管組織的觀察都是采用組織切片或者免疫熒光染色等,都是基于一種二維的觀察模式,Hu 等[32]在大鼠挫傷模型中使用Micro-CT 追蹤在川芎嗪治療脊髓損傷后微血管的3D 形態(tài)變化,并探討其對(duì)于血管再生的影響。 Brakel 等[33]注意到在部分大鼠完成脊髓損傷的造模后會(huì)出現(xiàn)類似于抑郁癥的一些行為學(xué)表現(xiàn),主要為飲食習(xí)慣的改變、運(yùn)動(dòng)功能的進(jìn)一步降低以及穴居行為的減少等,也發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)上述行為改變的同時(shí)動(dòng)物模型的心功能也發(fā)生了改變,因此他們通過建立脊髓挫傷模型來觀察抑郁癥行為與心功能之間的聯(lián)系從而探尋有關(guān)脊髓損傷后抑郁癥出現(xiàn)的發(fā)病機(jī)制。

3.2 急性壓迫模型

急性壓迫模型主要是模擬臨床中患者椎管狹窄閉塞或者外傷導(dǎo)致脊髓受壓損傷的情況,用來研究壓迫造成的影響以及尋求一種減壓的時(shí)機(jī)。 壓迫模型最為常見的是微血管夾/動(dòng)脈瘤夾直接鉗夾硬脊膜表面對(duì)其造成損傷。 Führmann 等[34]使用一種改進(jìn)的動(dòng)脈瘤夾以21 g 的力度鉗夾脊髓表面1分鐘造成脊髓損傷來研究硫酸軟骨素酶ABC 聯(lián)合神經(jīng)上皮細(xì)胞治療對(duì)損傷后組織再生效果。Soubeyrand 等[35]使用35 g 的力度的動(dòng)脈瘤鉗夾脊髓表面1 分鐘以構(gòu)建大鼠脊髓損傷模型,通過超高分辨超聲(very high resolution ultrasound,VHRS)來探測(cè)脊髓血管出血的情況,并通過組織學(xué)的方法進(jìn)行驗(yàn)證,證實(shí)了VHRS 可以實(shí)時(shí)定量地判斷脊髓損傷急性期和亞急性期的出血情況,既往認(rèn)為脊髓遭受損傷后會(huì)伴隨血管破裂導(dǎo)致髓內(nèi)出血[2],而血管的破裂往往在早期不易檢查。 使用鉗夾方式造成損傷使其在重復(fù)性、一致性上得到保證,但該方法仍需咬除椎板,對(duì)于脊柱后方結(jié)構(gòu)完整性有較大影響,該方式也同人體中常見脊髓損傷有一定的區(qū)別。

另外一種壓迫造模方式是使用球囊導(dǎo)管對(duì)脊髓造成壓迫,該造模方式只需在椎板上鉆孔即可以將球囊導(dǎo)管送至損傷位點(diǎn),對(duì)于脊柱后部結(jié)構(gòu)有較好的保護(hù)。 1953 年,Tarlov 等[36]首次描述了球囊壓迫模型,通過球囊的不同體積以及不同的停留時(shí)間可以較好地調(diào)控?fù)p傷程度。 Gong 等[37]使用導(dǎo)管對(duì)脊髓造成壓迫損傷后,通過留置的導(dǎo)管可以直接注射藥物。 Zheng 等[38]使用球囊導(dǎo)管的不同膨脹程度(根據(jù)球囊占椎管前后徑的比值)來對(duì)山羊造成壓迫損傷,并使用X 線和CT 觀察球囊的位置,計(jì)算球囊充氣的大小和椎管內(nèi)脊髓受壓的程度。 但由于球囊導(dǎo)管無法固定,損傷位點(diǎn)的一致性無法得到保證。

3.3 急性橫斷模型

急性橫斷模型是指使用顯微器械進(jìn)行完全/不完全脊髓橫斷。 與脊髓挫傷、壓迫模型不同,脊髓橫斷損傷模型能夠盡可能排除損傷區(qū)域殘留的神經(jīng)纖維對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響,可以有效地觀察外源性因素對(duì)于脊髓損傷修復(fù)的調(diào)控作用。 橫斷模型目前主要應(yīng)用于組織工程材料治療脊髓損傷中,適合于研究再生、退化、組織工程策略或神經(jīng)可塑性。 Yao 等[39]采用脊髓節(jié)段背側(cè)半切的造模方式來驗(yàn)證水凝膠支架對(duì)于大鼠脊髓損傷后軸突再生以及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。 Lukovic 等[40]比較詳盡地?cái)⑹隽思顾铏M斷模型的建立的過程,認(rèn)為該模型在觀察細(xì)胞移植對(duì)于脊髓再生潛能的影響方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 Kumar 等[41]發(fā)現(xiàn)在脊髓完全損傷的情況下會(huì)增加褥瘡出現(xiàn)的機(jī)率、降低皮膚愈合能力,且這種情況大多發(fā)生在損傷平面以下,這可能與傷口閉合和修復(fù)所需的各種細(xì)胞過程活性降低有關(guān)。 戴建武團(tuán)隊(duì)首次建立了比格犬脊髓完全橫斷模型,并對(duì)這種模型進(jìn)行評(píng)價(jià),認(rèn)為其評(píng)估神經(jīng)再生的情況是十分可靠的,同時(shí)也提出了脊髓完全橫斷模型由于其本身損傷較為嚴(yán)重可導(dǎo)致一些并發(fā)癥的出現(xiàn),如壓迫性潰瘍、深靜脈血栓(deep venous thrombosis,DVT)、骨質(zhì)疏松、肌肉痙攣、尿路感染和呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥等,建立了一套詳細(xì)的術(shù)后護(hù)理方案[42]。 但是這種損傷的情況在臨床中十分罕見,并不能真正地反映脊髓損傷后的病理改變。因此該模型更多應(yīng)用在驗(yàn)證生物材料、細(xì)胞治療對(duì)脊髓再生修復(fù)的作用。

3.4 急性牽拉/脫位損傷模型

急性椎體脫位造成脊髓損傷是臨床中常見的損傷機(jī)制之一,大約占脊髓損傷患者的32% ～58%[43]。 脫位模型是基于椎體移位對(duì)脊髓造成損傷,而牽拉模型則是通過椎體的軸向運(yùn)動(dòng)對(duì)脊髓施加軸向作用力造成拉伸損傷。 Wu 等[44]設(shè)計(jì)了一種椎體牽拉造成脊髓損傷的家兔模型,按照家兔的脊髓長度比例來造成損傷可以有效地模擬臨床損傷的機(jī)制,并且這種方法可以很好地避免損傷脊髓血供減少其帶來的其他損傷。 目前已經(jīng)大量的動(dòng)物模型證實(shí)盡早進(jìn)行減壓手術(shù)可以緩解由脊髓受壓引起的神經(jīng)癥狀[45],但是當(dāng)這一結(jié)果應(yīng)用于臨床中卻存在較大差異,早期手術(shù)有時(shí)并沒有取得明顯的療效[46],考慮其原因可能是因?yàn)樵谂R床前動(dòng)物模型中使用的生物力學(xué)變量與臨床損傷中發(fā)生的生物力學(xué)條件之間存在差異, Speidel 等[47]建立一種新型的大鼠椎體脫位模型來探討壓迫時(shí)間和損傷時(shí)的速度與脊髓損傷預(yù)后之間的關(guān)系,從而尋找一種最佳的手術(shù)減壓時(shí)機(jī)。 Bhatnagar 等[48]則是通過比較脊髓挫傷模型和椎體脫位造成脊髓損傷的方法首次嘗試量化不同損傷過程脊髓的形態(tài)變化,希望通過這樣的方法來解釋當(dāng)機(jī)械因素發(fā)生改變時(shí)是如何改變下游生物信號(hào)。

4 動(dòng)物模型的局限性

急性脊髓損傷模型研究發(fā)展迅速,但鑒于人類脊髓損傷的復(fù)雜性,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與臨床中人的脊髓損傷有很大差異。 目前尚沒有一種模型可以完全模擬人類急性脊髓損傷,每種脊髓損傷模型都有其局限性。 臨床中常見損傷為閉合性損傷,而在動(dòng)物模型的制備中常有剝離椎旁肌肉、椎板及韌帶咬除等情況,這樣不僅會(huì)造成局部的損傷,也會(huì)導(dǎo)致脊柱穩(wěn)定性的丟失,同時(shí)這些結(jié)構(gòu)的移除也可能對(duì)脊髓損傷后的病理生理改變?cè)斐梢欢ㄓ绊?另一方面,在臨床中對(duì)病人進(jìn)行感覺功能恢復(fù)的評(píng)估,但在動(dòng)物模型中無法進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。

綜上,大鼠是目前造模最常見的動(dòng)物,然而為了更好地進(jìn)行臨床前研究向臨床的轉(zhuǎn)化,選擇與人類更為相似的動(dòng)物模型已成為必然趨勢(shì),同時(shí)也應(yīng)當(dāng)根據(jù)自己的研究目的來選擇最合適的動(dòng)物模型。為了能夠更深層次地研究當(dāng)前脊髓損傷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)以及不斷出現(xiàn)的新觀點(diǎn)、新機(jī)制,對(duì)于動(dòng)物模型的探索研究仍需繼續(xù)發(fā)展和改進(jìn),使其更加標(biāo)準(zhǔn)化、定量化、智能化,為推進(jìn)脊髓損傷治療研究奠定基礎(chǔ)。