松材線蟲病早期診斷技術(shù)研究評述

馬 躍，呂 全，于成明,李 琴，劉會香*，張星耀 *

1．山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018 2．國家林業(yè)局森林保護學重點實驗室，中國林業(yè)科學院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091 3.山東新河礦業(yè)有限公司嘉祥林場，山東 嘉祥 272400

松材線蟲病是以松材線蟲[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]為主導，通過松褐天牛等媒介昆蟲傳播的一種重大生物災害。我國于1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病，目前已擴散蔓延至全國16個省(市)，對我國現(xiàn)有松林資源、生態(tài)景觀和林業(yè)經(jīng)濟造成了極大破壞和嚴重威脅。隨著國際經(jīng)濟貿(mào)易往來的日益頻繁，松材線蟲病傳播擴散的風險也在不斷加大。雖然國內(nèi)外學者已對松材線蟲病進行了廣泛研究，但該病害發(fā)生和防控形勢依然嚴峻，發(fā)病早期不易診斷而無法及時采取措施以及感病松樹難以治愈仍然是松材線蟲病防治的難題。因此，加強對松材線蟲病的監(jiān)測預警，運用簡單易行的早期診斷方法，及時發(fā)現(xiàn)疫情，徹底清除病死樹，控制疫情擴散，是防治該病的重要手段。本文就國內(nèi)外現(xiàn)行的松材線蟲病早期診斷技術(shù)進行了總結(jié)評述，并對未來新技術(shù)的研究進行了展望。

1 現(xiàn)行早期診斷技術(shù)評述

1.1 林間癥狀診斷法

此法是依據(jù)感病植株在田間表現(xiàn)的典型癥狀來診斷病害。松樹感染松材線蟲病通常表現(xiàn)如下癥狀和規(guī)律：松樹感病后針葉逐漸失綠，變黃，最后變?yōu)榧t褐色，倒掛枝上不脫落，遠觀似火燒狀，針葉萎蔫是從基部開始，通常從局部發(fā)展到整體；發(fā)病樹樹干上通常能夠觀察到天牛產(chǎn)卵刻槽、蛀屑，嫩枝上可見松褐天牛補充營養(yǎng)的取食痕跡；樹體流膠減少或停止；木質(zhì)部往往有藍變現(xiàn)象；感病樹木通常是樹冠濃密、樹勢健壯的優(yōu)勢木等[1]。

該方法適用于林間病害普查，適合熟悉當?shù)亓窒嗉安∠x害發(fā)生與危害情況的相關(guān)技術(shù)人員使用，需憑借豐富的經(jīng)驗來判斷，主觀性強，容易誤診或漏診。該方法通常僅作為對松材線蟲病的初步判斷，與病原鑒定法結(jié)合應用，準確率高，實際應用普遍。

1.2 病原線蟲鑒定法

對病害最可靠、最直接的診斷方法就是對其病原物的鑒定。在松材線蟲病發(fā)病早期癥狀不易判斷時，對疑似病死樹取樣的木材進行分離線蟲并鑒定病原，是松材線蟲病早期診斷的主要方法之一。

1.2.1 形態(tài)學鑒定法 松材線蟲主要的形態(tài)學鑒別特征有：唇區(qū)高，溢縮明顯；口針細，基部稍微膨大；中食道球橢圓形，占體寬的2/3以上；背食道腺開口于中食道球；排泄孔的位置大致和食道球與腸交接處平行；雌蟲卵巢1個，陰門位于蟲體中后部73%處，有陰門蓋；雄蟲交合刺大，弓形，喙突明顯，交合刺遠端膨大；熱殺死后雌蟲呈開闊“C”形，雄蟲成“J”形。該法應用中最大難點在于區(qū)分與松材線蟲同屬的無致病力或致病力弱的擬松材線蟲(B.mucronatus)。兩者主要區(qū)別在于：松材線蟲雌成蟲尾部近圓柱形，尾端鈍圓或有很短的尾尖突(不超過2 μm)，而擬松材線蟲雌成蟲尾部有較長的尾尖突(超過3.5 μm)；松材線蟲雄成蟲交合傘為卵圓形，而擬松材線蟲雄成蟲交合傘為板狀，端部平截[2-3]。

形態(tài)學鑒定法操作簡單易行，不需要復雜的儀器設備，一直是生產(chǎn)和研究上廣泛采用的方法。但也存在一些不足：線蟲形態(tài)特征不穩(wěn)定，幼蟲期很難鑒別，培養(yǎng)出成蟲需要一定時間；砍取木材耗費人力物力且毀壞樹木，浸泡分離線蟲又耗時；要求分離操作過程要規(guī)范，鏡檢人員要有豐富經(jīng)驗。

1.2.2 生化檢測法 蛋白質(zhì)電泳檢測法 根據(jù)線蟲親緣關(guān)系相近的種或種下類群的蛋白質(zhì)分子量大小不同，通過PAGE電泳或瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)凝膠上顯示的蛋白質(zhì)譜帶的不同進行分類標記，即可鑒定松材線蟲，由于蛋白質(zhì)呈現(xiàn)的譜帶包含所有可溶性蛋白，所提供的信息復雜，較難分析，限制了該法的應用[4]。

同工酶分析檢測法 近30年來，國內(nèi)外許多學者對松材線蟲和擬松材線蟲株系進行了同工酶差異的研究，篩選出酯酶、蘋果酸脫氫酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶[5]等一些可將兩者區(qū)分開來的酶。也有研究表明其特異性不明顯，所需樣本數(shù)量較大，蛋白質(zhì)的表達影響因素較多，實際應用中存在一定局限性。目前為止，還沒有哪種同工酶被公認為可以明確地區(qū)分松材線蟲與擬松材線蟲。

免疫學檢測法 利用免疫學原理，白鋼等[6]以疫木上分離的松材線蟲的粉碎蟲體免疫家兔制備抗血清，通過免疫印跡考察抗血清的特異性，利用固相松材線蟲抗原和游離線蟲抗原同線蟲抗體相競爭，建立競爭型ELISA法用于松材線蟲的分析，同時還利用抗松材線蟲血清建立了在疫木切面上直接進行免疫組化染色檢測松材線蟲抗原的方法。曹宇等[7]用種子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球，以兔抗松材線蟲IgG致敏，制備出了能特異性地捕獲松材線蟲蛋白抗原的免疫磁性微球，用生物素標記抗體為示蹤抗體，并結(jié)合酶標親和素檢測系統(tǒng)用于疫木樣品的檢測。該方法可直接捕獲木屑中的微量線蟲抗原，具有簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點。

纖維素酶擴散法 纖維素酶是一種與松材線蟲病致病性相關(guān)的重要物質(zhì)。Kojima等[8]將松材線蟲分泌物進行電泳分析，發(fā)現(xiàn)松材線蟲分泌的纖維素酶的譜帶類型與擬松材線蟲的不同。Kikuchi等[9]實驗發(fā)現(xiàn)該纖維素酶產(chǎn)生于松材線蟲的食道腺，并克隆出它的基因。蔣麗雅等[10]利用纖維素酶擴散法對線蟲蟲體提取液和分泌液進行了定性檢測，結(jié)果表明松材線蟲蟲體內(nèi)含纖維素酶并向體外分泌，而擬松材線蟲等其它線蟲幾乎不含。張奇等[11]以松材線蟲分泌的一種抗原性纖維素酶為指標建立了選擇性抗體酶聯(lián)免疫分析方法(SAEIA)，可簡便、快捷地檢測出疫木中存在的纖維素酶，具有較好的特異性。

以上幾種松材線蟲的生化檢測技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、方法簡單、結(jié)果穩(wěn)定、易于觀察、耗時較短等優(yōu)點，但是所用儀器設備較為復雜，技術(shù)要求相對較高，只適宜于在高等院校、出入境檢疫檢驗機關(guān)等有條件的機構(gòu)進行，不適宜于基層林業(yè)機構(gòu)。

1.2.3 分子生物學檢測法 分子生物學檢測技術(shù)是通過分析線蟲DNA特有的基因組區(qū)域而做出準確鑒定的方法。松材線蟲的DNA較為穩(wěn)定，找到它與其它線蟲差異的DNA片段即可作為分子檢測依據(jù)。相關(guān)的分子生物學檢測技術(shù)主要包括探針技術(shù)以及基于PCR的各種檢測技術(shù)，例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、SCAR標記、PCR-RFLP、ITS-PCR、特異引物(PCR)、實時定量(Real-time PCR)、核酸雜交檢測(Nucleotide hybridization)等技術(shù)，目前應用較多的是實時定量檢測技術(shù)與SCAR標記檢測技術(shù)，具有檢測時間短、檢測準確性高等優(yōu)點[12-14]。松材線蟲分子檢測試劑盒的研發(fā)使用更為方便快捷。分子生物學檢測技術(shù)克服了形態(tài)鑒定、生理生化檢測方法存在的一些缺陷，精確度高，越來越廣泛地被應用，但此類技術(shù)只適合于技術(shù)設備允許的實驗室內(nèi)應用。

1.3 流膠法

松樹樹脂分泌減少至停止是感染松材線蟲病的早期癥狀之一，可作為早期診斷的依據(jù)。松樹分泌樹脂的能力可分為5個等級：一級流膠，樹脂從孔口外流，且滲出量很多；二級流膠，樹脂從孔口外流，且滲出量較多；三級流膠，樹脂沉積在孔口下緣；四級流膠，樹脂滲出在圓孔壁上，呈粒狀；五級流膠，孔壁上無樹脂流出。劉偉等[15]將三級流膠作為感病的標志，楊寶君等[16]研究了松樹品種、接種量及線蟲來源對流膠法的影響，進一步證明了流膠法作為松材線蟲病樹早期診斷的可靠性。

流膠法是最早應用于松材線蟲病林間活立木早期診斷的方法，該法簡單、易行、易辨認。由于影響松樹流脂的其他因素較多，影響了該方法診斷結(jié)果的準確性，且松樹一旦流膠停止后就很難挽救了，該法僅作為一種輔助診斷方法。

1.4 化學法

1.4.1 酸性品紅追蹤法 根據(jù)松樹感染松材線蟲病早期有揮發(fā)性物質(zhì)滲漏入導管產(chǎn)生氣穴而阻礙樹液上升的現(xiàn)象，楊偉東等[17-18]采用酸性品紅追蹤樹液流動的情況，根據(jù)莖干橫切面著色情況判斷是否有揮發(fā)性物質(zhì)滲漏入導管，以此判斷是否為松材線蟲病。其它原因引起枯萎的松樹并不會出現(xiàn)松脂滲漏現(xiàn)象，因此，該法可以在發(fā)病早期還未出現(xiàn)外觀癥狀時診斷馬尾松松材線蟲病。該方法對松材線蟲病的檢疫防治和品種抗性鑒定研究均有重要意義，但該方法不便于操作，也不能用于林間活立木檢測，其實用性還有待于深入研究。

1.4.2 pH指示劑法 王玉嬿、李海燕等[19-21]根據(jù)受害樹木木材酸度增加的現(xiàn)象，研究出利用酸堿指示劑在松木上的顏色變化來快速檢測松材線蟲病方法。分別用0.04%的溴酚蘭酒精溶液與0.04%二甲基黃酒精溶液對待檢松樹木盤或木屑進行染色，3～5 min后可觀察到前者染色后健康木為紫羅蘭色，而感病木顏色變?yōu)辄S綠色或黃色，且松材線蟲為害越嚴重黃色越明顯，準確率可達85%以上；后者染色后健康木為黃色，而感病木變?yōu)榧t色，且松材線蟲為害越嚴重紅色越明顯，準確率約60%。

此方法簡單易行，可達到快速檢測的目的，但兩種指示劑均不能將松材線蟲和天牛、擬松材線蟲等為害的病死木區(qū)分，而且松木的pH值變化與多種因素有關(guān)，存在地域差異和樹種差異，對不同樹種、不同地區(qū)采用的指示劑及其顯色的標準等有待深入研究。

1.4.3 顯色法 王明旭等[22]的實驗將顯色劑加入木屑浸泡液中，感病木的顯色由淺紅色、紅色直到深紅色，且松材線蟲含量越多顏色越深，而感染擬松材線蟲的松材呈清白色或無色，健康木無色。該方法操作簡便、穩(wěn)定性好、準確性高、檢測時間短，具有較好的發(fā)展前景，適用于生產(chǎn)一線監(jiān)管的檢疫檢驗人員。

1.5 電生理學方法

將聲、光、電等多種原理應用到植物病害診斷技術(shù)中是一個很好的研究方向。傅和玉基于植物組織發(fā)生病變早期，細胞膜透性改變，電容值急劇縮小這一原理，綜合生物學、電子學和傳感技術(shù)研制出了便攜式多種功能植物病害診斷儀[23]，并對林木枝干傳染性病害腐爛病等和生理性病害低溫災害進行了試驗驗證，診斷準確率較高[24]。梁軍等[25]對受松材線蟲侵染與未受侵染的馬尾松樹體干部電容、電阻、單位電容和枯葉率等指標進行了測定，結(jié)果表明馬尾松被松材線蟲侵染后樹體電容下降、電阻升高，差異顯著。若以樹體干部電容值0.50 nF為臨界閾值，低于該值為受松材線蟲侵染馬尾松，高于該值為未受侵染馬尾松，準確率可達89 %，可以依此診斷病害。

綜合上述兩人研究成果，依據(jù)松樹感染松材線蟲病后樹體電容值下降的原理，改進植物病害診斷儀，將其應用到松材線蟲病的早期診斷中，具有很高的研究價值。但是目前電指標測定方法和評價指標并不具備特異性，電指標出現(xiàn)異常只能說明樹木樹勢受到了某一或某些因素的干擾，還需要結(jié)合樹木外觀癥狀、生理指標等其他方法綜合確定具體的干擾因素。該方面技術(shù)的深入研究開發(fā)將對松材線蟲病的早期無損診斷技術(shù)研究具有重要的科學意義和實用價值。

1.6 光譜學方法

王震等[26]對野外不同受害類型的馬尾松進行了反射光譜測定，并對反射率曲線進行了分析，研究結(jié)果表明馬尾松不同受害類型的光譜特征變化明顯，且呈現(xiàn)出較好的光譜變化規(guī)律，即在綠光區(qū)(550 nm左右)和近紅外區(qū)域(760 nm左右)，隨發(fā)病程度的加深，反射率有明顯的下降。這種變化規(guī)律對于在松材線蟲入侵過程中，應用遙感技術(shù)研究森林資源的動態(tài)變化非常有價值，值得進一步研究并應用到實踐中去。

杜華強等[27]對野外疑似松材線蟲的馬尾松進行反射光譜連續(xù)測量，在對反射光譜數(shù)據(jù)紅邊位置、綠峰反射高度和紅谷吸收深度分析的基礎上，進一步利用分形理論計算450～780 nm之間的反射光譜曲線的分形維數(shù)，可作為馬尾松健康狀況預測的指標。分形理論在松材線蟲病早期預測中具有一定的潛力，相關(guān)研究還有待進一步深入。

1.7 早期檢測管法

潘滄桑[28]發(fā)明了一種早期檢測管用于松材線蟲病的早期診斷，即將帶有生物活性物質(zhì)的

檢測管插到樹上，幾天后通過檢測管壁即可知該株松樹是否有松材線蟲。中科院動物研究所趙莉藺等人[29]在早期檢測管的基礎上研發(fā)了松材線蟲化學信息取樣技術(shù)，即在松材線蟲不同的生活周期，檢測管內(nèi)加入不同的化學信息物質(zhì)對樹體內(nèi)松材線蟲進行引誘，再通過鏡檢形態(tài)鑒定或其他線蟲鑒定方法鑒定病原，還對不同發(fā)病時期松樹上取樣部位進行了實驗研究。

該方法既實現(xiàn)了松材線蟲病早期診斷，又可使松樹免于削皮砍伐之患，達到保護松林生態(tài)景觀的目的。此外，該法操作簡便，準確率高，不必帶大量樣品回室內(nèi)檢測，減輕了檢疫檢驗人員的工作，可以滿足森林防疫機構(gòu)的需要，適用于野外大規(guī)模病害診斷及普查監(jiān)測，具有廣闊的應用前景。

1.8 其它方法

1.8.1 松枝解剖法 來燕學[30]將便攜式顯微鏡與松枝解剖技術(shù)結(jié)合應用，實現(xiàn)了對松材線蟲病的快速診斷。即剪取松枝后用解剖刀進行松枝切片，再用便攜式顯微鏡鏡檢。用該法在林內(nèi)鑒定一個樣本平均耗時2.5 min，方法簡單效率高，但取樣和測樣過程具主觀性，存在漏診或無法診斷等弊端，有待進一步驗證改進。

1.8.2 松褐天牛引誘輔助診斷法 松材線蟲主要依靠松褐天牛攜帶傳播，采用林間掛設松褐天牛誘捕器或設立誘木引誘松褐天牛，進而分離其成蟲體內(nèi)攜帶的松材線蟲或由松褐天牛攜帶到誘木上的松材線蟲，并鏡檢鑒定線蟲的種類，可輔助診斷松材線蟲病[31]。蔣麗雅等[32]通過林間設置松褐天牛引誘劑裝置，對引誘到的松褐天牛分離其體內(nèi)線蟲并鏡檢，10min后就能判定有無松材線蟲存在。

該方法操作相對簡單易行，尤其在松褐天牛羽化的高峰期，檢測效率較高。實際應用中在林間癥狀診斷的基礎上，再結(jié)合病、死樹體內(nèi)線蟲分離鑒定法或松褐天牛引誘輔助診斷法，可以取長補短，提高診斷的準確率。

2 展望

松材線蟲病早期診斷技術(shù)研究是實現(xiàn)這一重大生物災害早期預警的綜合防控關(guān)鍵技術(shù)手段之一。目前很多診斷方法或受條件或受技術(shù)的限制而不完善，尚需繼續(xù)探索和研究。未來松材線蟲病早期診斷技術(shù)應向更為簡單易行、快速、精確、無損、高效、適用于林間活立木等方向發(fā)展。

松材線蟲病早期診斷實用技術(shù)的研究創(chuàng)新可以嘗試從以下幾個方面突破：pH指示劑法方便快捷，可通過進一步實驗研究制定變色標準；研制便攜式儀器用于野外活立木診斷；將納米檢測手段應用到松材線蟲病早期診斷技術(shù)研究中；研究松材線蟲分泌的纖維素酶的特異性，并將其作為松材線蟲病診斷的特異性信號應用，還有其它一些檢測信號在感病樹體中的分布和捕獲都將是未來的研究重點；應用電學，光譜學等物理學原理進行松材線蟲病早期無損診斷技術(shù)研究也是一個重要的研究方向，已有研究成果為松材線蟲病早期診斷儀器的研制提供了重要的實驗數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，還有待于深入研究其特異性及實用性。

松材線蟲病早期診斷技術(shù)的不斷完善創(chuàng)新對更好地診斷該病害的發(fā)生，從源頭控制病原，防止疫情擴散，保護森林生態(tài)環(huán)境，具有重大的經(jīng)濟、生態(tài)與社會意義。通過深入研究改進現(xiàn)有方法及多學科相互滲透，松材線蟲病的早期診斷技術(shù)將會取得突破性進展。

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