骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與乙肝病毒的相互作用

曹毅，宋紅麗（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192；2.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津300192）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BM MSCs）作為一種易分離、純化、體外擴(kuò)增、多能分化的干細(xì)胞，在細(xì)胞因子的幫助下可以增殖、遷移，分化成肝細(xì)胞并具有其功能，同時(shí)擁有弱的免疫原性。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）可以感染BM MSCs并在其內(nèi)表達(dá)，導(dǎo)致其增殖匱乏，但不會(huì)影響它的免疫表型、向肝細(xì)胞分化并具有肝細(xì)胞樣作用的能力。同時(shí)BM MSCs可以通過(guò)消除在其細(xì)胞內(nèi)的HBV而抵制其長(zhǎng)期感染機(jī)體。所以研究者們考慮使用BM MSCs移植療法來(lái)治療乙型肝炎晚期肝硬化、肝癌的患者，有效減輕排斥反應(yīng)，為今后的臨床應(yīng)用提供更合適的方法。

BM MSCs是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，具有易分離、純化、體外擴(kuò)增，自我更新及多向分化能力強(qiáng)、免疫原性弱、移植后很少發(fā)生免疫排斥反應(yīng)和不涉及倫理問(wèn)題等特點(diǎn)，在細(xì)胞治療和組織器官重建方面的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。病毒性肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，特別是HBV所引起的乙型肝炎。全球約有3億以上慢性病毒性肝炎及其病毒攜帶者，而我國(guó)約有1.2億慢性病毒性肝炎感染者。目前原位肝移植是治療各種肝功能失代償期、肝衰竭最有效的治療方法，但因?yàn)楦卧慈狈?、費(fèi)用昂貴、以及移植后的并發(fā)癥等限制了其廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，新的干預(yù)性治療通過(guò)利用外源性的BM MSCs移植來(lái)達(dá)到幫助損傷組織或細(xì)胞修復(fù)與再生的目的。本文圍繞BM MSCs的特性、它與HBV的相互作用，其移植入體內(nèi)的影響的國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BM MSCs的特性、來(lái)源、體外培養(yǎng)與應(yīng)用

1.1 BM MSCs的發(fā)現(xiàn)、特性及應(yīng)用

1867年，Cohnheim在研究傷口愈合時(shí)，首次提出骨髓中存在非造血干細(xì)胞，指出成纖維母細(xì)胞可能來(lái)源于骨髓。1976年，F(xiàn)riedenstein等［1］從骨髓細(xì)胞中培養(yǎng)出這種纖維原細(xì)胞，并證實(shí)其易貼壁、在體外大量擴(kuò)增、呈集落樣生長(zhǎng)，并具有定向分化的特點(diǎn)。1997 年 Prockop［2］、1999 年 Pittenger等［3］先后分別證明了這種纖維原黏附細(xì)胞中包含間充質(zhì)干細(xì)胞，具有分化為多種間質(zhì)組織（如骨、軟骨、脂肪和平滑?。┑哪芰?。鑒于這些特點(diǎn)，人們把這群細(xì)胞命名為BM MSCs。

BM MSCs是一種具有特征性形態(tài)、表型及功能性質(zhì)的細(xì)胞，它能夠強(qiáng)表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD105， 弱 表 達(dá) CD106， 不 表 達(dá) CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45［3］及人類白細(xì)胞抗原（HLA）Ⅰ抗原和HLAⅡ抗原［4］，不表達(dá)或低表達(dá)移植免疫排斥相關(guān)的表面標(biāo)志 CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L［5］。其中，CD29屬于整合素家族，CD105是間充質(zhì)相關(guān)抗原，CD14是單核/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志，CD11a是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1，CD34和CD45是造血干細(xì)胞（HSC）表面標(biāo)志，CD31是內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志。說(shuō)明BM MSCs不具備造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及移植排斥的特性。

BM MSCs是造血微環(huán)境中的主要細(xì)胞成分，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子，如缺氧誘導(dǎo)因子-1a（HIF-1a），誘導(dǎo)產(chǎn)生干細(xì)胞生長(zhǎng)因子保護(hù)細(xì)胞和組織［6］；或表達(dá)與HSC黏附、歸巢有關(guān)的黏附分子及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白［5］，對(duì)HSC的生長(zhǎng)、增殖、分化起著重要作用。BM MSCs、臍血CD34+HSC和銅螯合劑共培養(yǎng)使HSC增殖明顯增加［7］。Koh等［8］發(fā)現(xiàn)BM MSCs可能在HSC表觀遺傳調(diào)控中也起了一定的作用。

BM MSCs具有在體外容易擴(kuò)增的特性，在短時(shí)間內(nèi)可以擴(kuò)增上千倍。這是BM MSCs廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床的重要前提。

BM MSCs具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下，它不僅能分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱等中胚層組織細(xì)胞，而且能夠向外胚層組織細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞［9］、尿道上皮細(xì)胞［10］）和內(nèi)胚層組織細(xì)胞（如心肌細(xì)胞［11］、肝細(xì)胞［12］）分化。Wakitani等［13］將體外擴(kuò)增的BM MSCs輸注給24例進(jìn)行了高位脛骨切開的膝關(guān)節(jié)炎患者，42周后缺損部位已被軟組織填充并有軟骨樣組織形成。所以BM MSCs可以用于骨組織工程，參與組織修復(fù)。Rodrigo等［14］發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞植入到急性心肌梗死的患者身上是方便且安全的，它能促進(jìn)血管和心肌細(xì)胞的再生。體外的BM MSC可以通過(guò)加入細(xì)胞因子［15］、與肝細(xì)胞或類固醇激素［16-17］混合培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成肝細(xì)胞、刺激內(nèi)皮細(xì)胞再生、增強(qiáng)纖維基質(zhì)降解，同時(shí)擁有肝細(xì)胞的功能。當(dāng)然所分化細(xì)胞所在器官特殊的微環(huán)境是BM MSCs分化的最適合條件［16］。

1.2 BM MSCs的體外培養(yǎng)

BM MSCs易分離、純化，其體外分離方法主要有四種：① 密度梯度離心法。② 貼壁篩選法。③ 流式細(xì)胞儀分選法。④ 免疫磁珠分選法。其中貼壁篩選法操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞損傷較少，被廣泛應(yīng)用［18］。

體外培養(yǎng)的BM MSCs體積比較小，核仁明顯，培養(yǎng)時(shí)貼壁，可聚集成均勻的集落，生長(zhǎng)曲線呈“S”型［19］，擴(kuò)增一代和兩代后的細(xì)胞同質(zhì)性分別達(dá)到95%和98%。細(xì)胞的大小、形態(tài)和匯合度可以用倒置顯微鏡來(lái)觀察。脂肪誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)可以驗(yàn)證BM MSCs生長(zhǎng)效果。脂肪的誘導(dǎo)分化通過(guò)油紅O染色作為20天后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的指示。成骨的誘導(dǎo)分化用堿性磷酸酶檢測(cè)14天后誘導(dǎo)效果。茜素紅染色作為21天后細(xì)胞外基質(zhì)鈣化的指示［20］。

1.3 細(xì)胞因子與BM MSCs的關(guān)系

細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素（IL）、干擾素（INF）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、生長(zhǎng)因子（GF）和趨化性細(xì)胞因子六大類。

BM MSCs分泌有大量的GF，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等［21］。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1（SDF-1）/CXCR4軸［22］、PDGF、EGF 及其配體肝素［23-24］可以使調(diào)整BM MSCs遷移，使其生存能力和增殖能力顯著提高，促進(jìn)血管生成細(xì)胞因子分泌，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。Western bloting和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）顯示SDF-1預(yù)處理可以激活具有促進(jìn)生長(zhǎng)的蘇氨酸激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2/B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)蛋白的比值。FGF4和HGF通過(guò)有絲分裂活化蛋白激酶細(xì)胞信號(hào)途徑（MAPK cell-signing pathway）提高BM MSCs分化成肝細(xì)胞的能力［25］。門脈注射人HGF基因修飾的BM MSCs后，免疫排斥反應(yīng)受到抑制，肝功能顯著改善，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4和IL-10水平增加，細(xì)胞凋亡水平降低，增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)水平增加，大鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)。并發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白不會(huì)影響B(tài)M MSCs的作用［26］。值得注意的是所有細(xì)胞因子與BM MSCs的作用都是在具有充分血清營(yíng)養(yǎng)的前提下發(fā)揮的［27］。

2 HBV與BM MSCs之間的作用關(guān)系

Ma等［28］第一次發(fā)現(xiàn)人BM MSCs能支持挑剔的HBV感染、復(fù)制、表達(dá)和藏匿，且HBV感染后BM MSCs形態(tài)不變。由于病毒基因通過(guò)整合或者轉(zhuǎn)染而不是感染進(jìn)入細(xì)胞，所以BM MSCs比Hep G2更適合作為查看HBV生命周期和原始病毒與細(xì)胞相互作用機(jī)制的工具。BM MSCs用HBV陽(yáng)性血清培養(yǎng)的1天后，細(xì)胞內(nèi)、外乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）、乙肝病毒的共價(jià)環(huán)狀閉合脫氧核糖核酸（cccDNA），培養(yǎng)基中乙肝表面抗體（HBsAg）、乙肝核心抗體（HBcAg）、乙肝e抗體（HBeAg）等相繼出現(xiàn)，并且發(fā)現(xiàn)HBV體外感染 BM MSC 與人初級(jí)肝細(xì)胞［29］和人肝癌細(xì)胞株［30-31］相比，不同的地方在于HBcAg的高表達(dá)。結(jié)果顯示存在于BM MSC中的病毒部分是半徑50 ～200 nm的球形。這些病毒成分、HBsAg及HBcAg存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，提示HBV在細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)錄并表達(dá)抗原。

HBV抑制BM MSCs的體外擴(kuò)增，但不會(huì)影響B(tài)M MSCs的免疫表型、向肝細(xì)胞分化并具有肝細(xì)胞樣作用的能力［32］。Zhong 等［20］收集 15 份來(lái)自于慢性乙型肝炎和肝硬化患者的BM MSCs、11份來(lái)自于有著同樣的年齡結(jié)構(gòu)的健康人的BM MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)。用RT-PCR分析，BM MSCs及其生存的培養(yǎng)基中均未檢測(cè)到HBV DNA和mRNA的存在，但細(xì)胞上的PDGF-α、PDGF-β、IGF-1和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)都減少。排除年齡因素后，GF表達(dá)的減少造成患者BM MSCs的增殖減少。需要進(jìn)一步的研究評(píng)估慢性乙型肝炎患者更多的GF和其BM MSCs上細(xì)胞因子的多樣性。

BM MSCs對(duì)HBV有抵抗力，在BM MSCs中檢測(cè)不到cccDNA基因組和前RNA基因組，提示HBV不能在BM MSCs或內(nèi)皮祖細(xì)胞中復(fù)制［33］。Xie等［34］對(duì)乙肝患者體外培養(yǎng)至第3、4、5代的BM MSCs進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)、外及其培養(yǎng)基中HBV DNA、HBsAg和HBcAg均顯示陰性。健康人的BM MSCs及其第6、12、18天誘導(dǎo)的類肝細(xì)胞在含有HBV的血清感染環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)，大約80%的細(xì)胞免于感染。胡維亨和任軍［32］觀察HBV陽(yáng)性血清培養(yǎng)的人BM MSCs大約半數(shù)以上擴(kuò)增受阻，但是只有不到5%的細(xì)胞可以檢測(cè)到病毒表達(dá)。所以他從這份低病毒表達(dá)率上得出結(jié)論，BM MSCs對(duì)HBV是有抵抗的。

Rong等［33］發(fā)現(xiàn) BM MSCs能吞噬 HBV，幫助它進(jìn)入受傷的組織中。

3 BM MSCs移植療法治療乙肝終末期肝病

BM MSCs是一類免疫缺陷細(xì)胞，可以抑制T細(xì)胞的增殖和激活，通過(guò)可溶性因子的介導(dǎo)來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）、前列腺素 E2（PGE2）、吲哚胺雙加氧酶（IDO）［35］等因子可能參與BM MSCs的免疫調(diào)節(jié)，減少免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。

肝硬化是肝病的晚期階段。而肝硬化的主要病理變化就是肝纖維化。肝纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積累過(guò)多和受傷區(qū)域的疤痕組織的形成。在受傷的肝臟中，活化的肝星狀細(xì)胞（HSC）是主要的ECM產(chǎn)生細(xì)胞，能夠合成大量的細(xì)胞基質(zhì)蛋白。BM MSCs能誘導(dǎo)活化的HSC凋亡而終止肝硬化進(jìn)展［36］。Mohamadnejad 等［37］治療4例晚期肝硬化患者，體外培養(yǎng)BM MSCs經(jīng)肘靜脈注射回患者體內(nèi)。所有患者均無(wú)死亡及并發(fā)癥出現(xiàn)。Sakaida等［38］將自體骨髓細(xì)胞移植入用標(biāo)記著綠色熒光蛋白的四氯化碳（GFP/CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝硬化模型，移植的細(xì)胞在損傷的肝組織內(nèi)有效增殖分化為肝細(xì)胞，改善肝臟功能，提高了患病小鼠的生存率。Parekkadan等［39］發(fā)現(xiàn)BM MSCs可以分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及肝臟血管再生，促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖并向肝臟遷移，提高了大鼠生存率。Peng等［40］的研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎引起的肝衰竭患者自體BM MSCs移植是安全的，短期明顯改善肝臟功能，但長(zhǎng)期的肝細(xì)胞性肝癌發(fā)病率或病死率沒(méi)有顯著差異。

自體移植后的排斥反應(yīng)很弱，可以克服臨床上的移植排斥問(wèn)題。異種移植的免疫反應(yīng)比自體移植的要強(qiáng)烈些，但也比肝移植的免疫排斥弱得多。而且BM MSCs容易獲得，并能在體內(nèi)廣泛分化而不涉及倫理問(wèn)題，對(duì)于肝臟來(lái)說(shuō)以BM MSCs為基礎(chǔ)的治療比其他干細(xì)胞都適合。但需注意的是由于BM MSCs能吞噬HBV，幫助它進(jìn)入受傷的組織中，可能引起乙肝反彈。所以我們不能給有其他組織受傷的乙肝患者進(jìn)行BM MSCs的移植。

4 總 結(jié)

BM MSCs移植是藥物治療和手術(shù)治療之后的又一場(chǎng)醫(yī)療革命。病毒性肝炎及其晚期肝硬化、肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，2004至2012年我國(guó)共報(bào)告病毒性肝炎發(fā)病數(shù)13 501 863例，年均發(fā)病率為112.960/10萬(wàn)，年均死亡率為1.007/10萬(wàn)，在5種類型肝炎中，乙肝發(fā)病數(shù)最多，占病毒性肝炎傳染病總數(shù)的82.125%［41］。因?yàn)楦卧慈狈?、費(fèi)用昂貴、以及移植后的并發(fā)癥等限制了原位肝移植的廣泛應(yīng)用。所以外源性BM MSCs移植將成為未來(lái)的新興的治療方法。不過(guò)要實(shí)現(xiàn)將BM MSCs移植應(yīng)用于臨床上，還有很多的關(guān)鍵問(wèn)題需要解決，例如，如何處理BM MSCs移植后的乙肝再感染問(wèn)題，BM MSCs感染HBV后的產(chǎn)物能否在人體內(nèi)獲得容許存在下去。BM MSCs轉(zhuǎn)化成肝細(xì)胞后，是否表達(dá)主要組織相容性抗原，發(fā)揮免疫調(diào)控［42］。如何保持間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外大規(guī)模培養(yǎng)后的分化能力、遺傳特征、致瘤性和穩(wěn)定性；如何建立干細(xì)胞產(chǎn)品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量評(píng)價(jià)體系等等。另外，建立健全規(guī)范的法律法規(guī)和統(tǒng)一的生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也是發(fā)展間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)的關(guān)鍵。只有通過(guò)嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)審查，才能防止損害公眾利益的事情發(fā)生。