環(huán)境硒形態(tài)測定中預(yù)處理與分析方法的研究進(jìn)展

胡 婷，向昌國

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界427000；2.吉首大學(xué)生態(tài)旅游湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界427000）

硒(Se)是人體的必需微量營養(yǎng)元素之一，具有防癌抗癌、清除體內(nèi)自由基、抗衰老等作用，缺硒會(huì)引起如貧血、冠心病、大骨節(jié)病、克山病、糖尿病等40余種疾病[1]。硒元素的性質(zhì)和硫元素很相似，在環(huán)境中存在多種氧化形態(tài)，包括以有機(jī)化合物和無機(jī)化合物形態(tài)存在[2]。在天然水環(huán)境中存在可溶態(tài)的Se2-，硒元素態(tài)以膠狀形式存在，亞硒酸主要以HSeO3-和SeO32-形式存在，硒酸鹽主要以SeO42-形式存在，有機(jī)態(tài)的硒常以蛋白質(zhì)形態(tài)存在于生物體中[3]。不同形態(tài)的硒存在顯著的地球化學(xué)差異，影響著硒在地質(zhì)環(huán)境中的遷移、循環(huán)、生物可利用性和毒性[4]。在環(huán)境中硒的功能作用和毒性與形態(tài)也密切相關(guān)，其中無機(jī)硒有較大的毒副作用，而有機(jī)硒的毒性小[1]。補(bǔ)硒工程的推進(jìn)以及富硒產(chǎn)品的開發(fā)對硒形態(tài)分析的要求越來越高，形態(tài)分析比傳統(tǒng)的總量分析復(fù)雜很多，因?yàn)榇蠖鄶?shù)食品中硒含量比較低，而聚硒在前處理的過程中容易揮發(fā)和轉(zhuǎn)化。為了克服這些難題，近些年來，科技工作者從新技術(shù)手段的引用(主要表現(xiàn)為分析儀器的聯(lián)用技術(shù))、前處理的改進(jìn)等方面對食品中硒的形態(tài)分析做了大量工作，以實(shí)現(xiàn)對不同基質(zhì)的食品進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的定量和定性分析。本文綜述了硒形態(tài)分析預(yù)處理方法及其主要的分析方法。

2 硒形態(tài)分析預(yù)處理方法

形態(tài)分析的預(yù)處理在硒形態(tài)分析中占著極其重要的地位，預(yù)處理提取率的高低直接影響實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于硒形態(tài)的不穩(wěn)定性，樣品的提取過程應(yīng)盡量保持硒形態(tài)的原始特性不變，比僅僅檢測硒元素復(fù)雜得多，也是植物硒形態(tài)分析準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。目前并沒有固定的預(yù)處理方法，按其提取方式主要分以下四種：液相萃取（LPE）、微波輔助萃?。∕AE），固相微萃?。⊿PME）以及液相微萃?。↙PME）。

2.1 液相萃取

液相萃取實(shí)際使用中主要有沸水提取[5-6]、0.1mol HCl提取[7-9]、5mmol檸檬酸提取[10]、25mmol乙酸銨提取[11]、1︰1甲醇水（v︰v）提取[12]以及蛋白酶水解提取[13-15]及加壓液體萃取法[16]（PLE）等。分析上述各種液相萃取方法發(fā)現(xiàn)，水提對無機(jī)硒和一般非結(jié)合態(tài)的蛋白硒較適宜；酸提（鹽酸和檸檬酸）的提取率較高，但在提取過程中導(dǎo)致硒形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變的情況比較嚴(yán)重；酶解提取應(yīng)用較為廣泛，常用的蛋白酶有蛋白酶K，蛋白酶XIV，胰蛋白酶，胃蛋白酶和鏈霉蛋白酶，但提取時(shí)間長，需要根據(jù)環(huán)境中不同樣品對蛋白酶進(jìn)行篩選。

液相萃取過程中按照使用輔助儀器的不同，分為萃取提取、振搖提取、超聲提取、離心提取、微波提取等，其中超聲微波結(jié)合酶提取法可以有效縮短提取時(shí)間[17]。加壓液體萃取法在錫和砷形態(tài)分析上得到應(yīng)用，但在硒形態(tài)分析上應(yīng)用較少[11]。輔助儀器的使用能在一定程度上提高樣品中硒的提取率，Maira[17]等研究發(fā)現(xiàn)在蛋白酶提取過程中加入超聲輔助后提取率有一定的提高，但對0.1mol/LHCl緩沖液和25mmol/L乙酸銨溶液提取加入超聲輔助提取后硒代胱氨酸（SeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet）的提取率反而降低[18]，因此超聲微波結(jié)合酶提取法提取效果較好。

液相萃取是實(shí)驗(yàn)室常用的提取硒形態(tài)的方法之一，該方法操作簡便、可控性強(qiáng)，但該法提取率不高，需要進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化。

2.2 微波輔助萃取

MAE根據(jù)不同物質(zhì)吸收微波能力的差異使得基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使得被提取物質(zhì)從基體或體系中分離，進(jìn)入到介電常數(shù)較小、微波吸收能力相對差的萃取劑中，達(dá)到提取目的，該法適用于批量處理熱不穩(wěn)定性物質(zhì)，具有溶劑消耗少、污染小、時(shí)間短、安全性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。王阮云[19]等和Hsieh[20]等發(fā)現(xiàn)，MAE過程中硒的主要四種形態(tài)Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeMet、SeCys的回收率能達(dá)到95%～101%，提取效果較好。

2.3 固相微萃取

SPME過程是無溶劑的，將纖維頭浸入樣品溶液中或頂空氣體中一段時(shí)間，同時(shí)攪拌溶液以加速兩相間達(dá)到平衡的速度，待平衡后將纖維頭取出插入氣相色譜汽化室，熱解吸涂層上吸附的物質(zhì)。被萃取物在汽化室內(nèi)解吸后，靠流動(dòng)相將其導(dǎo)入色譜柱，完成提取、分離、濃縮的全過程。Campillo[21]等應(yīng)用HS-SPME提取GC-AES檢測分析得到DMSe和DMDSe的回收率高于88%。SPEM適用于揮發(fā)性或半揮發(fā)性有機(jī)化合物，優(yōu)點(diǎn)在于可用于處理量極小的樣品、耗費(fèi)時(shí)間短、成本低、方便操作等，然而大部分的水溶態(tài)不適于直接用SPEM。

2.4 液相微萃取

LPME[22]發(fā)展于LPE之上，是將微量的有機(jī)萃取液插入樣品或懸于樣品之上，在溶劑用量上，可以看作是LPE的微型化，萃取與進(jìn)樣都只需一個(gè)極簡單的裝置—微量進(jìn)樣器，且萃取和濃縮一步完成，方便、簡單、快速、污染少、便宜，且能達(dá)到與SPME相同的萃取效果。Saleha[23]等采用HF-LPME提取，應(yīng)用高效液相色譜檢測水質(zhì)中Se（Ⅳ），該方法檢出限低于3.7%。

3 硒形態(tài)分析

目前對于硒的測定方法有許多種，既包括常用的熒光分光光度法、分光光度法、原子熒光法、原子吸收光譜法和種子活化法，也有簡單實(shí)驗(yàn)條件下的重量法、滴定法、比色法、伏安法，還包括高精度實(shí)驗(yàn)條件下的催化極譜法、氣液色譜法、ICP-AES法、ICP-MS法和中子活化法(NAA)[24]?；诃h(huán)境樣品中硒形態(tài)復(fù)雜的特點(diǎn)，需要對其進(jìn)行高精度的分離，實(shí)驗(yàn)過程中常采用聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析[25]。硒形態(tài)分析聯(lián)用技術(shù)主要分為三個(gè)部分，分別為分離、檢測和鑒定。完成預(yù)處理的樣品通過各種分離柱使形態(tài)在通過柱子的過程中發(fā)生分離，再通過聯(lián)用裝置中的檢測器對各形態(tài)進(jìn)行檢測。

3.1 硒形態(tài)分析分離聯(lián)用

在聯(lián)用裝置中處于分離角色的主要有高效液相色譜法（HPLC）、體積排阻法（SEC）、反相或離子對反相法（RP/IP-RP）、離子交換法（IE）等。

HPLC是一種具有高效的分離技術(shù)，尤其適用于熱穩(wěn)定性差、分子量大、極性較強(qiáng)的物質(zhì)的分離，是目前常用的分離手段。Sandra[26]等應(yīng)用體積排阻色譜柱分析芥菜和向日葵中有機(jī)硒形態(tài)，并分離出樣品中硒蛋白的主要成分硒代蛋氨酸；Emese[27]等采用離子交換法成功地從胡蘿卜中分離出硒代蛋氨酸；Emese[28]等采用反相離子對色譜法從北蔥樣品中分離出Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet、SeCys四種主要形態(tài)。

3.2 硒形態(tài)分析檢測聯(lián)用

環(huán)境中硒形態(tài)的檢測主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）、原子吸收光譜（AAS）、原子熒光光譜（AFS）、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）、中子活化分析（INAA）等。大部分報(bào)道分析硒形態(tài)主要是Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet、SeCys四種形式[40]，通常采用ICP-MS進(jìn)行檢測，該法有靈敏度高、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，并且可與高效液相色譜（HPLC），毛細(xì)管電泳（CE）耦合形成HPLC-ICP-MS，CE-ICP-MS分析系統(tǒng)成為目前硒形態(tài)分析應(yīng)用較為廣泛的方法[10,12,26-28]。HPLC與具有極低的檢測限、較寬的動(dòng)態(tài)線性范圍、干擾少、分析精密度高、速度快和可測定多元素等優(yōu)點(diǎn)的ICP-MS聯(lián)用，能夠較精確地檢測出生物環(huán)境中的多種形態(tài)[29]。仲娜[9]建立了HPLC-ICP-MS分析方法，該法分離情況、出峰情況均較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%。Stephane[39]采用HPLCUV-HG-AFS檢測出四種形態(tài)的檢出限分別為Se(Ⅳ)19 pg、Se(Ⅵ)36 pg、SeMet28 pg、SeCys60 pg，該法的重復(fù)性能夠達(dá)到與ICP-MS相同的效果。張濤[25]通過建立SEC-UV-ICP-HPLC方法分析富硒大米提取液清蛋白中硒形態(tài)，通過比較280 nm紫外光下的蛋白圖譜和ICP-MS測定的80Se得到的質(zhì)譜圖分析富硒大米清蛋白中含硒蛋白組份的分布。

Capelo[30]等詳細(xì)描述了AAS和AFS作為元素檢測方法在硒形態(tài)分析中的應(yīng)用，指出AAS和AFS能夠代替ICP-MS成為測量結(jié)果可靠、儀器運(yùn)行成本低、可與色譜分離方法聯(lián)用的檢測手段。Moreno[31]等使用PV-GCAFS法對富硒大蒜中的可揮發(fā)性硒化合物進(jìn)行分析；Tsopelas[32]等利用LC-ICP-AES法分析了6種硒化合物的標(biāo)準(zhǔn)物。也有人采用其他方法測定硒的含量，如中子活化法等。Killa[33]等將反相液相色譜與雙電極化學(xué)檢測結(jié)合使用。謝能泳[34]等對SeO3、SeO4在離子色譜上的行為進(jìn)行了研究。吳迪[36]采用流動(dòng)氫化物發(fā)生電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜（HG-ICP-AES）測定了溫莪術(shù)中硒元素的含量。程慶龍[37]分別用ICP-AES法測定蜂蜜中硒元素的含量，并與AAS法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)用2種方法測定蜂蜜中硒元素的含量值接近，無顯著性差異，但I(xiàn)CP-AES法較AAS法具有簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。由此可見，硒的形態(tài)分析將隨著各種選擇性好、靈敏度高的分離檢測技術(shù)的應(yīng)用而不斷取得新的進(jìn)展[35]。

3.3 硒形態(tài)分析鑒定聯(lián)用

硒形態(tài)鑒定方法主要是基質(zhì)輔助激光解附電離（MALDI-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（INAA）。MALDI是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。ESI-MS也是一種軟的電離方式，在一定的電壓下它不會(huì)使樣品分子產(chǎn)生碎片，因此對于小分子的樣品ESI譜圖可確定樣品的組成成分有幾種。但對于大分子的蛋白質(zhì)來說，由于要形成非常復(fù)雜的多電荷峰，因此，分析大分子混合物較為困難，一般只用于分析較純的大分子化合物。Larsen[38]等利用IE-HPLC-ESIMS在海藻的三氯乙酸提取液中鑒定出二甲基硒丙酸(DMSeP)的存在，從而推測從二甲基硒丙酸到二甲基硒的轉(zhuǎn)變可能是硒生物地球化學(xué)循環(huán)過程中一條重要的代謝途徑。

4 結(jié)語

硒的功能活性和作用機(jī)理與攝入硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)。形態(tài)分析前的預(yù)處理占有極其重要的地位，目前尚未有固定的預(yù)處理方法，從本文分析的多種預(yù)處理方法來看，其中液相萃取是目前使用最為廣泛的提取方法，該法使用條件限制性較小，其中蛋白質(zhì)酶解提取是目前實(shí)驗(yàn)室硒形態(tài)分析首選的預(yù)處理方法之一；微波輔助萃取能夠進(jìn)一步提高提取率，但是應(yīng)用并不廣泛；固相萃取更加適用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性硒形態(tài)的提??；液相微萃取快速、方便，由于該裝置價(jià)格較高，目前并未得到廣泛使用。近年來，應(yīng)用于硒及硒化學(xué)形態(tài)研究的技術(shù)越來越多，己在環(huán)境樣品、食物樣品中硒化合物及元素的形態(tài)和價(jià)態(tài)分析得到應(yīng)用，但由于植物體中基質(zhì)復(fù)雜，硒化合物的濃度偏低，并且許多待分析的含硒化合物無相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物可供參考，所以，目前為止還沒有一種植物體內(nèi)的硒化合物被完全分析清楚。硒形態(tài)測定常用的四種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。形態(tài)分析中常采用聯(lián)用技術(shù)，其中HPLC-ICP-MS是目前國外應(yīng)用最為廣泛的分析方法之一，該方法操作簡單、方便經(jīng)濟(jì)，但靈敏度和精確度差；而準(zhǔn)確度高、靈敏度好的，又由于設(shè)備價(jià)格不菲，國內(nèi)尚未普及。但HPLC-ICP-MS方法是微量元素形態(tài)分析的趨勢。故在選擇硒形態(tài)方法時(shí)應(yīng)既要考慮測定所要求的靈敏度、精確度、干擾因素，又要注意方法本身所需要的投入，包括儀器、材料、藥品和時(shí)間等。綜合考慮各方面因素，選擇一種適于目標(biāo)要求的準(zhǔn)確、有效、簡便的方法。

相信隨著現(xiàn)代分析檢測技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，環(huán)境樣品中含硒化合物的提取、純化、分離、檢測和鑒定方法都將會(huì)得到更進(jìn)一步的改進(jìn)和提高，更多分析方法和新型技術(shù)將會(huì)應(yīng)用到硒形態(tài)的測定中，為廣大工作者提供更為快速、準(zhǔn)確、高效和適用性廣的分析方法。

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