疫苗佐劑的研究進展

李丹 陳陽 劉宇 王爽 王巖 秦明偉 史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學研究所 黑龍江 齊齊哈爾 161000）（哈爾濱鐵路獸醫(yī)衛(wèi)生處 哈爾濱 150006）

佐劑最早來源于拉丁語“adjuvare”一詞，為“幫助”，是指能夠提高機體對抗原的適應性免疫應答的物質，能夠在免疫反應中誘導全面持久的免疫應答。在疫苗制劑中，佐劑的功能主要包括：增強疫苗抗原的免疫原性；促進細胞免疫和體液免疫，優(yōu)化免疫應答，促進免疫能力較弱人群中的免疫應答；增進抗原與黏膜之間的傳遞以及免疫接觸；減少疫苗成分中抗原的需求量以及在實施過程中的免疫接種次數；優(yōu)化抗原結構，維持抗原構象等。

從巴斯德至今近百年來已開發(fā)了許多菌苗和疫苗，但傳統(tǒng)的疫苗一般多為全菌或全病毒制成,其中含有大量非免疫原性物質，這些物質除具有毒副作用外也有佐劑作用，所以一般不需要外加佐劑。因此，很長一段時間以來主要是研究毒素、類毒素、抗毒素的學者在研究和使用佐劑。直到1925年，法國免疫學家兼獸醫(yī)學家Gaston Ramon發(fā)現如果在白喉和破傷風疫苗中加入某些與之無關的物質可以特異地增強機體的抵抗反應，從此佐劑引起了人們的注意，許多國家也開始不同程度的開展了這方面的研究。

1.傳統(tǒng)佐劑

1.1 鋁佐劑

鋁佐劑是目前獸用疫苗和人用疫苗上應用最廣泛的佐劑。鋁佐劑苗可以分為鋁沉淀疫苗和鋁吸附疫苗兩種，鋁沉淀疫苗是將鋁劑懸液加至抗原液中，鋁吸附疫苗是將抗原溶液加至氫氧化鋁或磷酸鋁中。兩種鋁佐劑疫苗不僅能夠減少抗原用量，還能夠增強機體的免疫應答。鋁佐劑通常用氫氧化鋁，其次是明礬及磷酸三鈣。

1926 年，Glenny發(fā)現用明礬沉淀的白喉類毒素懸液要比類毒素本身具有更高的抗原性，免疫豚鼠取得了較強的免疫效果。1931年，Glenny等又報道了氫氧化鋁吸附抗原制成的疫苗在注射部位具有緩慢釋放的功能，就此提出氫氧化鋁佐劑的作用機制為儲存庫效應。然而在1950年，Holteta首次對此機制提出質疑。長期以來關于鋁佐劑疫苗的具體機制尚不明確，但目前Glenny理論是對于鋁佐劑作用機制的主流解釋。隨著科學的發(fā)展和研究水平的提高，人們對于氫氧化鋁的作用機制不斷有了新的認識。

2004 年Rimanilo等研究發(fā)現氫氧化鋁佐劑可激活固有免疫應答。2007年Li等研究發(fā)現，巨噬細胞主要對抗原進行吞噬和破碎作用，鋁則激活細胞內源性免疫應答相關的Nalp3炎性復合體，促進巨噬細胞分泌產生高水平的促炎癥因子IL-1β 和IL-18。Eisenbart等進一步研究證實氫氧化鋁佐劑還可激活T2細胞分泌IL-4，誘導MHC-Ⅱ類分子和CD83、CD86等的表達，誘導Th2型體液免疫應答。2013年周洋證實鋁佐劑可升高血漿中促炎細胞因子和趨化因子水平。

Skeda等報道Alum的佐劑性是由吸附介導的，因此，Alum的佐劑性取決于鋁鹽對抗原的吸附程度。Alum對蛋白抗原的吸附還與靜電吸附和疏水性的相互作用有關。帶有陰電荷的重組瘧疾疫苗，與帶有陽電荷的Alum能很好結合，而與帶陰電荷的磷酸鋁則很難結合。另外，結合位點數目也是影響吸附的重要因素，在大分子中結合位點數目與分子量成正比。

雖然鋁佐劑是被FDA批準可用于人類疫苗的佐劑，其安全性和有效性得到了人們的公認，但鋁佐劑也有許多不足之處，如因其不能凍干，所以有些新型疫苗無法適用；當鋁佐劑通過皮下或皮膚內注射而不是肌肉內注射的路徑時通可產生肉芽腫；而且在許多情況下鋁鹽并不是一個好的佐劑，尤其是在誘導細胞免疫應答上，其可誘導產生體液免疫應答，但不能誘導產生細胞免疫應答，同時可誘導產生IgE 抗體產生，發(fā)生變態(tài)反應，增加發(fā)生超敏反應的危險。

1.2 油佐劑

此類佐劑在動物實驗中大量使用，一般包括水包油（O/W）或者油包水乳劑（W/O）和水包油包水雙相乳劑（W/O/W）。如是弗氏佐劑（FA），又可分為弗氏不完全佐劑（FIA）和弗氏完全佐劑（FCA），MF59，AS03，AF03和SE等。

弗氏佐劑（FA）是用礦物油（石蠟油）、乳化劑（羊毛脂）和滅活的分枝桿菌（結核分枝桿菌或卡介苗）組成的油包水乳化佐劑。這三種成分俱全的佐劑稱為福氏完全佐劑（Freund’s Complete Adjuvant,FCA），不含分枝桿菌的佐劑為福氏不完全佐劑（Freund’s Incomplete Adjuvant,FIA）。FIA是典型的只誘導Th2型細胞因子，誘生抗體的佐劑。FCA因其中含有滅活的分枝桿菌（長介菌）成份，是標準的誘生體液和細胞免疫佐劑，可誘導Th1型細胞因子，能夠促進IgG的產生，抑制IgM的產生，從而抑制免疫耐受的產生，推遲超敏反應，增加移植排斥，促進抗腫瘤作用。石蠟油因不能代謝而存留在注射的部位，這就阻礙了抗原降解或快速反應，起到抗原儲存作用，使抗原緩慢持續(xù)的釋放，不斷刺激機體的免疫系統(tǒng)而產生免疫反應。

但因為礦物油不能被代謝，所以會產生一系列的副作用，礦物油乳劑常見的副作用有注射部位的炎癥反應、肉芽腫、潰瘍等，另外礦物油以及其中的組分如姥鮫烷、正十六烷等還會引起佐劑型關節(jié)炎等自身免疫反應。對于人類常規(guī)的預防性疫苗來說乳劑的毒性太大，一般只是用于科學研究或癌癥患者。

隨著乳化技術的進步，可選擇代謝油取代初期的礦物油來制備更為安全、穩(wěn)定、有效的免疫佐劑，如MF59、AS03、AF03和SE等，MF59是目前研究較熱門的佐劑之一。MF59由角鯊烯（角鯊烯是一種較石蠟油更易代謝的植物油）、Tween-80和Span-85等組成，既可以刺激機體產生體液免疫也可以產生細胞免疫。MF59是除鋁佐劑外首個用于人類的新型佐劑，它能增強老年人群中流感的免疫原性，于1997年在歐洲獲得認證作為流感疫苗的佐劑。AS03與MF59類似，在歐洲認證用于流感疫苗，并在2009年H1N1流感大流行中得到廣泛使用。

2.新型佐劑

2.1 細胞因子類佐劑

細胞因子多屬小分子多肽或糖蛋白，相對分子質量在15 000～35 000之間，由活化的免疫細胞和相關細胞產生的，能影響其他細胞功能，對免疫應答、炎癥反應有介導和調節(jié)作用，是一類通過與高親和力的特異性受體相互作用，可在低濃度下發(fā)揮作用的生物活性物質。目前已有多種細胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和干擾素γ（IFN-γ）等作為病毒D N A 疫苗佐劑在實踐中得到應用，并有效增強了D N A疫苗的特異性免疫反應。這類物質可與抗原共表達而發(fā)揮佐劑作用，提高核酸疫苗的免疫保護率，或組裝成表達質粒，與抗原混合使用。

通過多年的研究，人們逐步對各種不同的細胞因子佐劑刺激機體產生的不同作用有了一個大致了解，細胞因子通過免疫調節(jié)提高抗原提呈能力，誘導并增強C T L 的作用；細胞因子佐劑能使機體持續(xù)產生抗體，并阻礙淋巴濾泡中生發(fā)中心的形成；細胞因子能將B 細胞與外周隔絕，使抗體生成下降，從而起到陰性免疫調節(jié)作用。

過去人們普遍認為IL-12是佐劑效果最好的細胞因子，研究發(fā)現IL-12抑制腫瘤細胞作用很強，并顯著增強了CTL活性，同時增加內源性IFN-γ 的分泌。最近IL-7和IL-15作為關鍵細胞因子被應用來增強CD8T細胞的免疫記憶。在DNA疫苗同編碼IL-15的基因聯合投遞增強免疫應答來對抗小鼠布氏桿菌感染的實驗中，小鼠接種此疫苗增強了體液免疫，布氏桿菌病特異性抗體IgG 2α 的量超過了IgG1，脾臟細胞內IL-15佐劑DNA疫苗誘導更高水平的IFN和CD8T細胞，同時對誘導CD4T細胞也有貢獻。

細胞因子在DNA疫苗應用中有特殊的潛力，細胞因子可以和抗原在同一載體里共表達。但因其分泌有可能增加誘導IgE產生，引起過敏反應，增加疫苗的不良反應。

2.2 CpG ODN佐劑

CpG是指由胞嘧啶、鳥嘌呤及使兩者相連的磷酸酯鍵組成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5，端和3，端的各兩個堿基構成CpG基序。人們發(fā)現細菌DNA具有較強的抗腫瘤作用，這種抗腫瘤作用是基于細菌DNA的強大免疫刺激功能，而這與其所含的非甲基化的CpG基序有關，因此CpG基序也被稱為免疫刺激序列，它是細菌DNA產生免疫刺激作用的核心結構。

目前以CpG ODN為佐劑的細菌類疫苗的研究涉及：炭疽桿菌疫苗、傷寒疫苗、白百破疫苗、流感嗜血桿菌疫苗、霍亂疫苗等。以CpG ODN為佐劑的病毒類疫苗的研究涉及：流感病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、單純皰疹病毒疫苗、生殖器皰疹病毒疫苗等。以CpG ODN為佐劑的寄生蟲類疫苗的研究涉及：曼森血吸蟲病疫苗、瘧疾疫苗、利什曼病疫苗、鼠弓形蟲疫苗等。

雖然CpG ODN具有安全有效等優(yōu)點，但還是有許多問題有待于解決：比如它的免疫激活機制、免疫劑量（高劑量CpG ODN及重復給藥可能導致毒性效應）和最適免疫途徑還需要進一步研究。目前CPG作為人用乙肝疫苗已進入臨床試驗。

2.3 脂質體佐劑

脂質體是由磷脂和固醇類組成的雙層脂質分子小球，能夠包裹抗原，其表面為疏水結構，內部為親水結構。脂質體既可做抗原載體又可做佐劑，用它包裹D N A 疫苗到達靶細胞后,脂質體與靶細胞融合并將DNA釋放入細胞進行表達。巨噬細胞等吞噬了含有抗原的脂質體，經溶酶體酶消化釋放抗原，可激活T 細胞及B 細胞。脂質體的佐劑效力依賴于脂質雙分子層的數量、電荷、組成成份以及制備的方法。

脂質體能顯著增強機體對抗原的免疫應答，包括產生保護性抗體和細胞免疫應答，還可以作為載體與其它佐劑（如脂質A、胞壁酰二肽及其衍生物、IL-1、IL-2等）或DNA疫苗聯合使用，刺激巨噬細胞分泌TNF-α、IF-γ、IL-6和IL-12,誘導CD8+細胞毒性T 細胞為主的免疫應答，同時增強APC的遞呈能力，從而增強機體免疫應答。

但作為疫苗佐劑脂質體也存在一些不足：穩(wěn)定性較差，磷脂中的不飽和脂肪酸儲存時會逐漸氧化，小脂質體傾向于相互融合成大脂質體，在融合過程中可以導致包入抗原的釋放。此外，佐劑與不同的抗原合用，其非特異性免疫調節(jié)作用是不可預知的，此外免疫途徑，抗原用量對特定脂質體疫苗免疫原性也有極大影響，所以單純脂質體作為佐劑的作用機理不可能得到全面的詮釋。同時脂質體在制備過程中要求一定的技術性，其費用也比其他免疫佐劑高，目前對脂質體的應用研究還主要集中在醫(yī)學研究方面，在獸醫(yī)疫苗研究中的應用前景還具有一定的不確定因素。

2.4 免疫刺激復合物（immunostinulating complex ISCOM）

ISCOM由皂角苷、膽固醇、磷脂以及抗原的磷酸鹽溶液組成。粒徑小于40nm，通過前3個組份之間的疏水作用而結合在一起，疏水的或親水的抗原均可以結合到其復合物上。主要通過增強APC的內吞作用，誘導黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫應答，產生持久的抗體滴度和保護性應答，可通過腸道外和黏膜途徑免疫。它適用于誘導細胞免疫反應的疫苗，正在臨床研究中的有流感病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗。

因ISCOM產生有效免疫所需的抗原很少，使其有可能成為多價亞單位疫苗的有效佐劑。ISCOM具有佐劑和抗原提呈的雙重功能，既可激發(fā)細胞介導的免疫反應，又可刺激體液免疫。臨床研究表明，ISCOM是目前誘導T淋巴細胞系（CTL）反應最強的免疫刺激物。

3.結語

合理選擇和使用佐劑不但可以節(jié)約抗原的使用量，還可以迅速刺激免疫系統(tǒng)，增強免疫應答。對佐劑的研究一直是疫苗研究過程中的重要環(huán)節(jié)，理想的佐劑應該是廣譜、無副作用、對免疫系統(tǒng)具備有效的激活作用，同時便于生產和使用。但是在佐劑大量出現的同時，隨之而來的是對其安全性的擔憂。因此，未來的工作重點之一應是深入研究佐劑的作用機制，全面推測其對免疫系統(tǒng)的影響，尋找并建立合理可靠的動物模型，預測免疫毒性發(fā)生的可能性。