HPLC法測定注射用核黃素磷酸鈉的含量

朱永琴，程 偉，景愛華，雷萬軍

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

HPLC法測定注射用核黃素磷酸鈉的含量

朱永琴1，程 偉2，景愛華3，雷萬軍3

目的建立HPLC測定注射用核黃素磷酸鈉中核黃素磷酸鈉的方法。方法采用Dikma DiamonsilTM- C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(20∶80)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：267 nm。結(jié)果此方法在4.01～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，最小檢出量為2 ng；平均加樣回收率99.86%，RSD=0.19%。結(jié)論本法快速、準(zhǔn)確、專屬性和重現(xiàn)性好，可用于注射用核黃素磷酸鈉的質(zhì)量控制。

HPLC法；核黃素磷酸鈉；含量測定

核黃素磷酸鈉別名為維生素B2磷酸鈉，為維生素類藥，臨床用于口角炎、唇炎、舌炎、眼結(jié)膜炎及陰囊炎等疾病的治療[1]。由于核黃素的極性小，其保留時間較長，整個分析約需45 min，另外峰較寬，檢測靈敏度較低[2]。根據(jù)中華人民共和國藥典2010版二部核黃素磷酸鈉含量測定項下的方法[2]和參考有關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，建立了高效液相色譜法測定注射用核黃素磷酸鈉中核黃酸含量的方法，有效減少了分析時間，提高了檢測靈敏度，適用于注射用核黃素磷酸鈉質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津)；Agilent8453 紫外可見分光光度計；AB204-N型梅特勒-托利多精密分析天平(瑞士梅特勒)；SPD-10Avp檢測器(日本島津)；核黃素磷酸鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：111640-200502)。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件采用LC-10ATvp高效液相色譜儀，色譜柱Dikma Diamonsil TM-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(20∶80)，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長267 nm。

1.2.2溶液制備避光操作。精密稱取核黃素磷酸鈉對照品適量，加流動相制成10 μg/mL的溶液，即得對照品溶液。同法制備核黃素磷酸鈉溶液做供試品溶液。取注射用核黃素磷酸鈉輔料制取成空白輔料溶液,過濾，作為空白溶液。在上述條件下，核黃素磷酸鈉的保留時間為16 min，理論塔板數(shù)按核黃素磷酸鈉峰計算為5610。按照處方比例稱取空白輔料，按供試品溶液的制備方法制備空白輔料溶液，在上述色譜條件下，取20 μL，注入液相色譜儀，輔料對主成分的測定無干擾。

1.2.3線性關(guān)系 精密稱取核黃素磷酸鈉對照品適量約(相當(dāng)于核黃素10.03 mg)，置50 mL容量瓶中，加流動相適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；精密量取上述貯備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的溶液，分別取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度(C)對峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=3.218×10C+1.030(r=0.9999)。結(jié)果表明，核黃素磷酸鈉在濃度在4.01～100 μg/mL范圍內(nèi)，C與A呈良好的線性關(guān)系。

1.2.4精密度試驗 精密稱取供試品適量，加流動相適量使溶解并稀釋制成每1 mL中含有核黃素10 μg的溶液，取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定核黃素磷酸鈉峰面積并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.20%(n=6)。表明精密度良好。

1.2.5穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測定核黃素磷酸鈉峰面積，并計算核黃素磷酸鈉峰面積積分值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.09%(n=6)。表明制備的供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.6重現(xiàn)性試驗 取同一批號樣品，按供試品溶液制備方法制備5份供試液，分別進(jìn)樣10 μL，測定核黃素磷酸鈉峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.16%，表示方法重現(xiàn)性良好。

1.2.7加樣回收試驗 按照處方比例的80%、100%、120%精密稱取核黃素磷酸鈉對照品和輔料，置于50 mL容量瓶中，加流動相適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，按含量測定項下的方法測定，計算回收率，得平均加樣回收率為99.86%，RSD為0.19%。

1.2.8最低檢出限 取對照品溶液用流動相稀釋制成一系列不同濃度的溶液，分別注入色譜儀,記錄其色譜圖。以S/N≥3計算，最低檢出限為2 ng。

1.2.9樣品測定 取本品適量(約相當(dāng)于核黃素磷酸鈉10 mg)，置于50 mL容量瓶中，加流動相適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取對照品適量，加流動相溶解并稀釋成每1 mL中含有核黃素磷酸鈉0.06 mg的溶液，作為對照品溶液，取上述溶液各20 μL，按照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算含量。三批樣品含量測定結(jié)果分別為100.9%、100.7%和100.8%。

2 討論

2.1檢測波長選擇精密稱取核黃素磷酸鈉對照品適量，加流動相制成10 μg/mL的溶液，通過紫外可見分光光度法在250～350 nm波長范圍對核黃素磷酸鈉進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在267 nm處檢測靈敏度較高且無其他干擾，故選擇267 nm為檢測波長。

2.2流動相選擇分別以四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶8∶4∶87)、乙腈-水(10∶90)、乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(20∶80)為流動相，對制備的對照品及供試品溶液進(jìn)行色譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶8∶4∶87)和乙腈-水(10∶90)均不能使樣品中核黃素磷酸鈉與相鄰峰完全分離，乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(20∶80)分離效果較好，樣品中核黃素磷酸鈉峰與相鄰峰完全分離，可滿足含量測定要求，故選擇乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(20∶80)為流動相。

2.3輔料干擾性試驗分別精密稱取注射用核黃素磷酸鈉樣品、核黃素磷酸鈉、空白制劑(除主藥核黃素磷酸鈉外的制劑)適量，按上述含量測定項下的方法制成每1 mL約相當(dāng)于核黃素10 μg的溶液，在250～350 nm之間進(jìn)行紫外掃描，核黃素磷酸鈉在267 nm波長處有最大吸收，樣品溶液、對照品溶液吸收曲線完全吻合、且此處空白液相對基線平坦，說明輔料對核黃素磷酸鈉的測定無干擾。

2.4其他本方法核黃素磷酸鈉色譜峰唯一且顯著，其他雜峰得到了有效抑制，各色譜峰峰值小，且峰與峰之間分離度達(dá)到要求，能更好地對樣品的質(zhì)量做出評價。

采用HPLC法測定核黃素磷酸鈉含量操作方便，專屬性強，重現(xiàn)性好，檢測限低，精密度、穩(wěn)定性及回收率均良好。適用于注射用核黃素磷酸鈉的含量測定，為控制本品質(zhì)量提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

[1]喬麗曼,樓旦,張慧.核黃素磷酸鈉在不同輸液中的穩(wěn)定性研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2010,48(28):42-43.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010：815-817.

[3]鄧潔雄.HPLC測定核黃素磷酸鈉中核黃素的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2006,22(1):53-54.

[4]郝桂明,唐素芳.高效液相色譜法測定核黃素磷酸鈉的有關(guān)物質(zhì)[J].天津藥學(xué),2008,20(4):30-31.

HPLCDeterminationofRiboflavinSodiumPhosphateforInjection

ZHU Yong-qin,CHENG Wei,JING Ai-hua,et al

(Henan Province Food and Drug Institute,Zhengzhou 450003,China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for determination of riboflavin sodium phosphate for injection.MethodsHPLC was used to determine directly riboflavin sodium phosphate for injection on C18 column with the mobile phase of CH3CN-0.025 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (20∶80) at a flow rate of 1.0 mL/min and column temperature was 25℃.The detection wavelength was set at 267 nm.ResultsThe calibration curve was linear in range of 4.01～100 μg/mL(r=0.9999).The limit of detection for the assay was 2 ng.The average recovery of the added sample was 99.86% and RSD was 0.19%.ConclusionThe method is quick,accurate,and has strong specificity and good reproducibility.It provides a good way for the quality control of riboflavin sodium phosphate for injection.

HPLC；riboflavin sodium phosphate；determination

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81071230)

2014-10-20

1.河南省食品藥品檢驗所，河南鄭州 450000 2.三門峽市公安局，河南三門峽 472000 3.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽 471003

朱永琴(1972-)，女，河南中牟人，副主任藥師，從事藥品檢驗檢測研究。

R927.2

A

1672-688X(2014)04-0241-02