遲鈍愛德華氏菌在水產(chǎn)動(dòng)物中致病性及致病因子的若干研究

劉雙鳳

（哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究分院 黑龍江 哈爾濱150028）

遲鈍愛德華氏菌又稱遲緩愛德華氏菌或緩慢愛德華氏菌，屬于腸桿菌科的愛德華菌屬（E d w a r d s i e l l a）。它是該細(xì)菌家族中較早發(fā)現(xiàn)的成員之一。于1959年由日本的S a k a z a k i和M u r a t a首先從蛇的腸道中分離得到。E.t a r d a是一種革蘭氏陰性短桿菌，沒有莢膜、芽孢，長(zhǎng)度約2~3 μm，直徑約l μm，有周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。該菌為兼性厭氧菌，生長(zhǎng)溫度范圍為5~42℃，最適生長(zhǎng)溫為25~35℃；適宜p H范圍為5.5~9.0，但p H7.2時(shí)生長(zhǎng)較好；耐鹽濃度范圍為0~4%。同時(shí)，E.t a r d a可產(chǎn)H2 S，能在膽硫乳瓊脂(D H L)上形成黑色中心的特征菌落。

H o s h i n a于1926年首次從養(yǎng)殖的鰻鱺中分離獲得魚源E.t a r d a分離株，并發(fā)現(xiàn)該菌與日本鰻鱺紅?。≧ e d d i s e a s e）有關(guān)。近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖的規(guī)?；笶.t a r d a成為嚴(yán)重威脅淡、海水魚類的細(xì)菌性病原，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。該菌能引起多種經(jīng)濟(jì)魚種的消化道疾病，其感染引發(fā)的出血性敗血癥被認(rèn)為是遲鈍愛德華氏菌病的典型病癥。此外，E.t a r d a病害的地理范圍很廣泛。我國(guó)渤海、黃海、東海沿海海域的養(yǎng)殖場(chǎng)，甚至內(nèi)陸的淡水魚、鱉等養(yǎng)殖場(chǎng)都有相關(guān)病例報(bào)道。另外，E.t a r d a還具有兼性胞內(nèi)寄生特性，是一種造成人、魚共患病的機(jī)會(huì)致病菌，直接威脅人類健康。早在1996年J o r d a n等就報(bào)道了人感染E.t a r d a的病例。目前為止，由生食魚類制品或機(jī)體創(chuàng)傷造成的人類感染E.t a r d a病例呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且能誘發(fā)多種并發(fā)癥。因此，在全面認(rèn)識(shí)E.t a r d a毒力因子和致病機(jī)制的基礎(chǔ)上，開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的減毒活疫苗，已成為我國(guó)乃至整個(gè)世界實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重要健康保障。

1.1 血清學(xué)方面的研究

P a r k e t a l對(duì)從養(yǎng)鰻池中分離到的幾百株遲鈍愛德華氏菌進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可以分成4個(gè)血清型: A、B、C和D，其中血清型A主要從腎臟中分離所得而且致病力最強(qiáng)。N a k a t s u g a w a首次報(bào)道了從牙鲆中分離到了一種無運(yùn)動(dòng)性的非典型遲鈍愛德華氏菌，可引起牙鲆發(fā)病。C o s t a e t a l從鯛中也分離到了這種菌，血清學(xué)研究表明這種菌與典型的從其它魚類分出的菌株有相似的表面抗原，因此認(rèn)為可以發(fā)展一種共同的疫苗針對(duì)這兩類病原。

1.2 與致病因子有關(guān)的研究

遲鈍愛德華氏菌致病機(jī)理的研究，尚處于起步階段。尋找研究致病物質(zhì)是了解病原致病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。

1.2.1 胞外產(chǎn)物

實(shí)驗(yàn)證明，水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的胞外產(chǎn)物中具有多種酶活性，其中蛋白酶(明膠酶或酪蛋白酶等)的活性對(duì)病原菌的致病性具有重要作用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，殺鮭氣單胞菌（A.s a l m o n i c i d a）、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌（P.a e r u g i n o s a）、熒光假單胞菌（P.f l u o r e s c e n s）、鰻弧菌（V.a n g u i l l a r u m）、溶藻膠弧菌（V.a l g i n o l y t i c u s）、副溶血弧菌（V.p a r a h a e m o l y t i c u s）、創(chuàng)傷弧菌（V.v u l n i f i c u s）、黃桿菌（F l a v o b a c t e r i u ms p.）等多種魚、蝦類病原菌均可產(chǎn)生具有強(qiáng)烈致病作用的胞外蛋白酶。在多數(shù)病原菌的胞外產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶都具有熱不穩(wěn)定性，但T h u n e等（1982）發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌可以產(chǎn)生2種胞外蛋白酶，1種為熱穩(wěn)定性蛋白酶，對(duì)鯰魚具有較強(qiáng)的致病力；另1種為熱不穩(wěn)定性蛋白酶，其致病力較弱。T a n a k a等認(rèn)為，副溶血弧菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶是一種誘導(dǎo)酶，在有明膠或其水解產(chǎn)物存在的條件下，蛋白酶的產(chǎn)生量為非誘導(dǎo)條件下的40倍左右在細(xì)菌的生長(zhǎng)早期，蛋白酶的分泌幾乎完全缺乏，到了生長(zhǎng)后期便開始迅速增加。

H o s h i n a報(bào)道稱熱滅活的遲鈍愛德華氏菌細(xì)胞對(duì)日本鰻鱺有致死作用，但培養(yǎng)液上清無致死作用。而S u p r a t o e t a l研究發(fā)現(xiàn)，該菌細(xì)胞內(nèi)容物和胞外產(chǎn)物都有致死作用，而胞外產(chǎn)物是直到細(xì)菌培養(yǎng)后期才有致死作用，認(rèn)為是由于后期發(fā)生溶細(xì)胞作用使內(nèi)容物釋放導(dǎo)致。S u p r a p t o e t a l從該菌的E C P（胞外產(chǎn)物）和I C C（胞內(nèi)成分）中分離到一種具有蛋白水解酶活性的物質(zhì)，對(duì)鰻有致死作用。陸承平證實(shí)遲鈍愛德華氏菌的胞外產(chǎn)物的的細(xì)胞毒性與動(dòng)物致病性平行，說明胞外產(chǎn)物是一種毒力因子。

1.2.2 內(nèi)毒素和外毒素

H o s h i n a認(rèn)為，遲鈍愛德華氏菌起致病作用的主要為內(nèi)毒素。U l l a h等報(bào)道，遲鈍愛德華氏菌能產(chǎn)生外毒素，該毒素能使兔發(fā)生皮膚壞死。J a n d a等發(fā)現(xiàn)，遲鈍愛德華氏菌培養(yǎng)上清對(duì)H E p-2細(xì)胞有毒性。S u p r a p t o等報(bào)道，遲鈍愛德華氏菌同時(shí)存在內(nèi)毒素和外毒素。另外發(fā)現(xiàn)了兩種外毒素，一種可引起兔皮膚紅斑，另一種可引起兔浮腫和潰瘍性紅斑。C h u n g e t a l從該菌中發(fā)現(xiàn)了幾種具有磷脂酶活性的外毒素，分別對(duì)磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和鞘磷脂等有特異活性。M a t h e w l e t a l利用基因突變的方式進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)遲鈍愛德華氏菌的芳基硫酸酯磺基轉(zhuǎn)移酶（a r y l s u l f a t e s u l f o t r a n s f e r a s e）基因和過氧化氫酶前體蛋白（c a t a l a s e p r e c u r s o r）基因發(fā)生突變時(shí)都可引起遲鈍愛德華氏菌毒性的大大降低。

1.2.3 溶血素

溶血素是多數(shù)病原菌的重要致病因子之一，目前已在殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、副溶血弧菌以及銅綠假單胞菌等病原菌的胞外產(chǎn)物中檢測(cè)到。Y a n a g a s e等認(rèn)為，副溶血弧菌產(chǎn)生的多種酶類均可引起溶血作用，包括磷脂酶A，溶血磷脂酶及其它2種直接溶血因子，一種為熱穩(wěn)定性因子，另一種為熱不穩(wěn)定性因子根據(jù)N o m u r a和S a i t o的結(jié)論，溶血素最初可能是以一種沒有溶血活性的前體形式存在，至細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)后期，在細(xì)胞內(nèi)形成并結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)膜上;至細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期，隨著細(xì)胞的自溶裂解而釋放到培養(yǎng)基中。

J a n d a等（1993）報(bào)道，E T溶血素呈細(xì)胞結(jié)合狀態(tài)，在常規(guī)條件下只有少量分泌到胞外，當(dāng)外界環(huán)境缺鐵時(shí)，胞外溶血素的分泌量是常規(guī)條件下的3～40倍。C h e n&H u a n g發(fā)現(xiàn)遲鈍愛德華氏菌可以分泌一種溶血素可以使羅非魚紅細(xì)胞壁產(chǎn)生孔洞。陸承平等報(bào)道，E T能產(chǎn)生兩種類型溶血素，即細(xì)胞結(jié)合性溶血素和胞外溶血素。培養(yǎng)基中加入螯合劑E D D A，造成外界環(huán)境缺鐵，E T21、S A8318、J F、122、735這5株出現(xiàn)兩種情況，兩株（E T21、S A8318）的胞外溶血素分泌顯著增加，而其余三株（J F、122、73）胞外溶血素的分泌無明顯變化?？梢姡珽 t產(chǎn)生溶血素的機(jī)制有一定的復(fù)雜性，細(xì)胞結(jié)合性溶血素的分泌未必受鐵調(diào)控，這J a n d a等的說法有異，有待進(jìn)一步證實(shí)。

1.2.4 侵襲素（粘附素）

U l l a h&A r a i在研究的菌株中沒有發(fā)現(xiàn)專門的侵襲素或粘附素，只是發(fā)現(xiàn)了一種粘性物質(zhì)可能與粘附和抵抗宿主的進(jìn)攻有關(guān)系。歐陽志明等報(bào)道，15株E T均能凝集紅細(xì)胞，但只有10株能粘附H e p-2細(xì)胞，其粘附能被純化的鞭毛所抑制。綜上分析，E T的粘附素組成較復(fù)雜，至少包括血凝素蛋白和鞭毛蛋白，不屬于一種結(jié)構(gòu)多種功能的模式。E T作為一種腸道致病菌，對(duì)宿主腸粘膜上皮是否也能像對(duì)H E p-2細(xì)胞一樣具粘附作用，其粘附素及其受體是否與體外模型顯示的結(jié)果一致，均有待進(jìn)一步證實(shí)。

L i n g e t a l利用綠色熒光蛋白(G F P)研究體外遲鈍愛德華氏菌對(duì)鯉魚上皮瘤細(xì)胞的粘附與入侵，發(fā)現(xiàn)該菌的內(nèi)化需微絲和蛋白酪氨酸激酶的作用，蛋白激酶C抑制劑可加速非毒性菌株的內(nèi)化，M A P K抑制劑則可阻礙毒性菌株的入侵。這為研究該菌與宿主關(guān)系提供了一種有用的工具，即綠色熒光蛋白。L i n g e t a l又利用G F P標(biāo)記的該菌研究發(fā)現(xiàn)，腸道、鰓和體表是該菌入侵的位點(diǎn)。

1.3 其它

M i n a g a w a e t a l稱一年四季都可從日本鰻鱺養(yǎng)殖池的水樣和泥樣中分離得到遲鈍愛德華氏菌，并且隨水溫的升高，分離到的菌的數(shù)量也越多。I s h i h a r a&K u s u d a研究發(fā)現(xiàn)水溫高時(shí)，從注射過遲鈍愛德華氏菌的日本鰻鱺體內(nèi)釋放病原的速度要比在低溫時(shí)快，若死去的魚體留在水中則水中的病原數(shù)量會(huì)迅速提升，比取走死魚的水中菌量高3個(gè)數(shù)量級(jí)。

綜上所述，盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)遲鈍愛德華氏菌進(jìn)行了大量的研究，但其治病機(jī)理仍沒有徹底搞清。在防治方面，由于使用抗生素類藥物的弊端，積極發(fā)展非抗生素類藥物勢(shì)在必行;而傳統(tǒng)免疫的方法從目前的研究狀況看，效果不是很理想;營(yíng)養(yǎng)免疫，從提高宿主本身的抗病機(jī)能出發(fā)，是一個(gè)比較好的發(fā)展方向;生物防治，從生態(tài)學(xué)角度出發(fā)，從根本上改善養(yǎng)殖環(huán)境，防止病害的發(fā)生，是很有發(fā)展前景的途徑，但這一研究方向正處于初級(jí)階段，而且有較高的條件要求，所以還有大量的工作要做。鑒于該菌能夠?qū)е露喾N嚴(yán)重的人類疾病，對(duì)該菌進(jìn)行深入的研究，防止和減少水產(chǎn)養(yǎng)殖中該病的發(fā)生，對(duì)于保護(hù)生產(chǎn)和保護(hù)人類健康都具有極其重要的義。