江西鉛山紅芽芋試管苗染色制片技術(shù)優(yōu)化研究

王艾平，柯維忠，林國(guó)衛(wèi)，吳燕芳，易雪梅，葉志康，黃麗，余琪，肖淮賓

(上饒師范學(xué)院，江西 上饒 334001)

紅芽芋(ColocasiaesculentaL. Schott var. cormosus cv. Hongyayu)，是江西省鉛山縣傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品，種植歷史悠久，其品質(zhì)鮮美、細(xì)膩，粉而不粘，口感好，且淀粉顆粒細(xì)小易被消化，品質(zhì)風(fēng)味居芋類之首[1]。研究表明，江西鉛山紅芽芋中碳水化合物含量較高，脂肪含量較低，蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)元素含量豐富，營(yíng)養(yǎng)全面，味香質(zhì)滑，香醇可口，具有良好的食用價(jià)值和開發(fā)前景[2]。近十余年來(lái)，江西鉛山紅芽芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為鉛山縣農(nóng)民增收致富的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，鉛山縣也成為江西省最大的紅芽芋生產(chǎn)基地[3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紅芽芋的栽培技術(shù)、組培快繁、種質(zhì)保存等方面進(jìn)行了較為廣泛的研究[4-7]，但對(duì)紅芽芋細(xì)胞學(xué)研究報(bào)道甚少。植物染色體制片是進(jìn)行植物學(xué)研究的基本技術(shù)，也是細(xì)胞分類學(xué)、染色體工程和植物育種學(xué)研究不可缺少的手段[8,9]。Belling(1921)提出植物染色體壓片技術(shù)后，壓片已成為植物染色體研究中最廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)[10]。許多研究表明，在植物組織培養(yǎng)的繼代過(guò)程中，試管苗容易發(fā)生染色體變異，其造成的影響有利有弊，有弊的是植物組織培養(yǎng)培育的試管苗不能保證原材料的遺傳穩(wěn)定性，有利的是這些變異可以用來(lái)培育和創(chuàng)制新品種。本實(shí)驗(yàn)擬探究不同因素對(duì)江西鉛山紅芽芋試管苗染色體制片效果的影響，旨在為江西鉛山紅芽芋的起源、演化及遺傳育種提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

江西鉛山紅芽芋脫毒苗(由江西省江天農(nóng)業(yè)科技有限公司提供)。

1.2　方法

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將江西鉛山紅芽芋脫毒苗的單芽逐個(gè)分離，然后接到高溫高壓滅菌的液體培養(yǎng)基中

(MS+KT2mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖，pH=5.8)，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照時(shí)間：14h/d；光照強(qiáng)度：1500-2000lx；溫度：25±1℃；濕度：70-80%)。30d左右，待紅芽芋試管苗幼根長(zhǎng)至3～4cm后，于上午9～11時(shí)剪下根尖(0.5cm)和已展開的幼葉。將剪下的根尖和幼葉分別置于0.1%秋水仙素+0.002mol/L 8-羥基喹啉混合溶液中，于室溫下浸泡預(yù)處理4h。用蒸餾水洗凈處理過(guò)的材料，經(jīng)卡諾氏固定液(乙醇：冰乙酸體積為3：1)固定24h，最后轉(zhuǎn)入70%的酒精中，4℃保存?zhèn)溆谩?chǔ)存的根尖或幼葉用蒸餾水洗凈后，置1mol/L的HCl中于60℃恒溫水浴鍋內(nèi)分別解離10 min，再用蒸餾水洗凈。用改良卡寶品紅染色液分別染色5 min。用醋酸漂洗1～3min。把根尖和幼葉放在載玻片上，加一滴染液，用鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，然后再蓋玻片上放一濾紙，用鉛筆橡皮頭輕輕敲擊蓋玻片，使細(xì)胞均勻分散。最后鏡檢，先用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)好的分裂相后，再轉(zhuǎn)到油鏡下觀察，并用數(shù)碼相機(jī)拍照。比較紅芽芋試管苗根尖或幼葉染色體的制片效果，篩選出最佳的染色體制片所需的取材部位。

篩選出取材部位后，再研究各個(gè)因素對(duì)紅芽芋試管苗染色體制片效果的影響。將剪下的材料分別置于0.1%秋水仙素溶液、0.002mol/L 8-羥基喹啉溶液以及0.1%秋水仙素+0.002mol/L 8-羥基喹啉混合溶液中，于室溫下浸泡預(yù)處理4h。用蒸餾水洗凈處理過(guò)的材料，經(jīng)卡諾氏固定液(乙醇：冰乙酸體積為3：1)固定24h，最后轉(zhuǎn)入70%的酒精中，4℃保存?zhèn)溆?。?chǔ)存的材料用蒸餾水洗凈后，置1mol/L的HCl中于60℃恒溫水浴鍋內(nèi)分別解離10 min 、15 min 和20min，再用蒸餾水洗凈。用改良卡寶品紅染色液分別染色4 min、6 min和10min。用醋酸漂洗1～3min。把材料放在載玻片上，加一滴染液，用鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，然后再蓋玻片上放一濾紙，用鉛筆橡皮頭輕輕敲擊蓋玻片，使細(xì)胞均勻分散。最后鏡檢，先用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)好的分裂相后，再轉(zhuǎn)到油鏡下觀察，并用數(shù)碼相機(jī)拍照。比較紅芽芋試管苗染色體的制片效果，篩選出最佳的預(yù)處理劑、1mol/LHCl解離時(shí)間以及改良卡寶品紅染色時(shí)間。

2　結(jié)果與分析

2.1　取材部位對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

分別對(duì)紅芽芋試管苗根尖和幼葉的染色體進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，用幼葉進(jìn)行染色體觀察時(shí)，細(xì)胞小、易碎、染色體不易觀察(見(jiàn)圖1(a))。而用根尖進(jìn)行染色體觀察時(shí)，細(xì)胞較大，不易破碎，染色體更易觀察(見(jiàn)圖1(b))。因此，紅芽芋試管苗染色體觀察的最好材料是根尖。

(a)紅芽芋幼葉細(xì)胞染色體(10×) (b)紅芽芋根尖細(xì)胞染色體(40×)圖1　取材部位對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

2.2　預(yù)處理劑對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

用0.1%秋水仙素、0.002mol/L 8-羥基喹啉、0.1%秋水仙素+0.002mol/L 8-羥基喹啉混合溶液分別處理紅芽芋試管苗根尖4h。結(jié)果表明：3種預(yù)處理劑均可觀察到根尖的染色體，但效果具有明顯差異。用0.1%秋水仙素預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞破碎嚴(yán)重，染色體高度重疊，不容易計(jì)數(shù)(見(jiàn)圖2(a))；用0.002mol/L 8-羥基喹啉預(yù)處理時(shí)，染色體細(xì)長(zhǎng)，分散也不好，也不易計(jì)數(shù)(見(jiàn)圖2(b))；而用0.1%秋水仙素+0.002mol/L 8-羥基喹啉混合溶液預(yù)處理時(shí)，染色體分散較好，比較容易計(jì)數(shù)(見(jiàn)圖2(c))。

(a)0.1%秋水仙素處理的紅芽芋根尖染色體形態(tài)(40×)　(b)0.002mol/L 8-羥基喹啉處理的紅芽芋根尖染色體形態(tài)(40×)

(c)0.1%秋水仙素+0.002mol/L 8-基喹啉處理的紅芽芋根尖染色體形態(tài)(40×)圖2　預(yù)處理劑對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

2.3　酸解離時(shí)間對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

預(yù)處理后，用 1 mol/ L 鹽酸溶液在常溫下對(duì)紅芽芋試管苗根尖分別解離10 min、15 min和20min，結(jié)果見(jiàn)圖3(a)-3(c)。結(jié)果表明：解離 10 min 時(shí)，根尖軟化程度不夠，很難觀察到染色體；解離 20 min 時(shí)，細(xì)胞容易破裂，也難以觀察到染色體；解離15min 時(shí)，細(xì)胞分散程度較好，且細(xì)胞破碎較少，比較容易觀察到染色體。

(a)1 mol/ L 鹽酸解離 10 min時(shí)紅芽芋根尖染色體形態(tài)(10×)　(b)1 mol/ L 鹽酸解離20min時(shí)紅芽芋根尖染色體形態(tài)(10×)

(c)1 mol/ L 鹽酸解離 15min時(shí)紅芽芋根尖染色體形態(tài)(10×)圖3　酸解離時(shí)間對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

2.4　染色時(shí)間對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

(a)染色10min時(shí)紅芽芋根尖細(xì)胞染色體形態(tài)(40×)　(b)染色4min時(shí)紅芽芋根尖細(xì)胞染色體形態(tài)(10×)

(c)染色6min時(shí)紅芽芋根尖細(xì)胞染色體形態(tài)(10×)圖4　染色時(shí)間對(duì)紅芽芋試管苗染色體觀察的影響

用 1 mol/ L 鹽酸溶液解離后，卡寶品紅染色時(shí)間對(duì)紅芽芋試管苗根尖染色體的觀察也有影響，如圖4(a)-4(c)所示。結(jié)果表明：染色時(shí)間為10min時(shí)，細(xì)胞質(zhì)與染色體均上色，無(wú)法清楚地觀察到染色體；染色時(shí)間為4min時(shí)，細(xì)胞質(zhì)幾乎不上色，但染色體上色的細(xì)胞也不多，不易找到分裂相較好的細(xì)胞；染色時(shí)間為6min時(shí)，細(xì)胞質(zhì)與染色體顏色對(duì)比較為明顯，可清楚觀察到染色體。

3　討論

在進(jìn)行植物染色體觀察時(shí)，植物取材的部位至關(guān)重要。一般可在根尖、莖尖和嫩葉等不同部位進(jìn)行取材。齊秀玲等[11]對(duì)草莓的染色體進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明，草莓染色體觀察的取材部位以根尖效果最好。薛陳心等[12]對(duì)歐洲黑莓的染色體進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)根尖取材簡(jiǎn)單用量少，可觀察到的分裂相較多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，用紅芽芋試管苗幼葉進(jìn)行染色體觀察時(shí)，細(xì)胞小、易碎、染色體不易觀察。而用紅芽芋試管苗根尖進(jìn)行染色體觀察時(shí)，細(xì)胞較大，不易破碎，染色體更易觀察。因此，對(duì)于植物染色體觀察來(lái)說(shuō)，根尖是較好的取材部位。究其原因，可能是莖尖和幼葉的細(xì)胞分裂指數(shù)較低[11]。但張永福等[13]對(duì)荔枝和龍眼部分珍稀種質(zhì)進(jìn)行染色體觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)用幼葉也能達(dá)到較好的效果。這可能是植物種類差異所致。

在進(jìn)行植物染色體觀察時(shí)，為了防止紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂停止在中期階段，增加細(xì)胞的分裂指數(shù)，材料一般要經(jīng)過(guò)預(yù)處理。預(yù)處理劑一般有二氯苯飽和水溶液、秋水仙素水溶液和8-羥基喹啉水溶液等，還可使用這些溶液的混合物，如秋水仙素與8-羥基喹啉混合溶液等。齊秀玲等[11]、陳是宇[14]和李慶玲等[15]發(fā)現(xiàn)，用對(duì)二氯苯飽和水溶液分別對(duì)草莓根尖、燕麥屬牧草、白掌和觀音蓮根尖進(jìn)行預(yù)處理2～3 h、4h、6 h和8h后，染色體觀察效果較好。張蜀敏等[16]和侯典云等[17]發(fā)現(xiàn)，新疆雪蓮組培苗和昭通半夏塊莖再生苗根尖置0.002 mg/L 8-羥基喹啉溶液處理，效果最好。于盱等[18]發(fā)現(xiàn)，薄荷屬植物根尖于0.1%秋水仙素溶液中浸泡12 h，容易觀察到染色體。張永福等[13]發(fā)現(xiàn)，荔枝和龍眼部分珍稀種質(zhì)的幼葉置于等體積的飽和對(duì)二氯苯和 2 mmol/L 8-羥基喹啉混合水溶液中預(yù)處理 3 -4 h，可以得到較多的分散良好、縊痕清晰、適合于計(jì)數(shù)及核型分析的染色體。薛陳心等[12]在歐洲黑莓的染色體觀察中，發(fā)現(xiàn)用0.02%的秋水仙素和2 mmol/L的8-羥基喹啉(1：1)混合液對(duì)根尖預(yù)處理2h，效果較好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，用0.1%秋水仙素+0.002mol/L 8-羥基喹啉混合溶液預(yù)處理時(shí)，紅芽芋試管苗根尖染色體分散較好，容易計(jì)數(shù)。因此，對(duì)植物進(jìn)行染色體觀察時(shí)，植物基因型不同，其預(yù)處理劑種類、濃度和處理時(shí)間也不同。

在進(jìn)行植物染色體觀察時(shí)，材料經(jīng)卡諾氏固定液固定后，需用1mol/L鹽酸在58-60℃恒溫下對(duì)材料進(jìn)行解離。解離的作用是除去細(xì)胞之間的果膠層并使細(xì)胞壁軟化以利于壓片[11]。新疆雪蓮根尖的適宜解離時(shí)間為5 min[16]。草莓根尖[11]和燕麥屬牧草根尖[14]的適宜解離時(shí)間為10 min。白掌和觀音蓮根尖[15]的適宜解離時(shí)間分別為10 min和15min。薄荷屬植物根尖[17]的適宜解離時(shí)間為15～20min。荔枝和龍眼部分珍稀種質(zhì)根尖[13]的適宜解離時(shí)間為1h。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，對(duì)于紅芽芋試管苗根尖染色體觀察而言，1mol/L鹽酸解離的適宜時(shí)間為15min。這個(gè)結(jié)論與觀音蓮根尖[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

植物染色體觀察的關(guān)鍵一步是染色。染色一般可用改良的卡寶品紅或乙酸洋紅。但許多研究表明，改良的卡寶品紅染色比乙酸洋紅染色效果更好，具有分色清晰、操作簡(jiǎn)便快速、耐久不褪色等優(yōu)點(diǎn)[11]。但改良卡寶品紅染色時(shí)間也很重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，江西鉛山紅芽芋根尖染色時(shí)間為6min時(shí)，細(xì)胞質(zhì)與染色體顏色對(duì)比較為明顯，可清楚觀察到染色體。但對(duì)于白掌和觀音蓮根尖[15]、新疆雪蓮組培苗根尖[16]，其改良卡寶品紅的適宜染色時(shí)間為20 min。而薄荷屬植物根尖[18]要求改良卡寶品紅的染色時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2h以上。因此，植物根尖改良卡寶品紅染色的時(shí)間也因植物種類而異。

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