流動注射聚離子敏感膜電極檢測三磷酸腺苷

雷佳宏，丁家旺，秦　偉

(1.海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室 中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264000；2.中國科學院大學，北京 100049)

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)廣泛存在于各種生物體中，參與蛋白質、糖、脂肪等的代謝過程，并為生物體的生命活動直接提供能量[1-2]；此外，ATP在環(huán)境分析、藥物分析、臨床診斷等方面也有著廣泛的應用[3-4]。因此，對ATP準確快速的檢測具有重要意義。

目前，ATP的檢測方法有層析法、電泳法[5]、HPLC法[6]、質譜法[7]、熒光素酶法[8]、生物發(fā)光法[9]以及電化學方法[10-11]等。其中，電化學方法因具有靈敏度高、易于操作等優(yōu)點，得到了廣泛應用；而核酸適體由于其穩(wěn)定、價廉，成為快速檢測ATP的理想分子識別體。研究發(fā)現，核酸適體富含磷酸根基團，能夠與聚陽離子魚精蛋白發(fā)生較強的靜電作用[12]。將魚精蛋白作為指示分子，利用聚離子敏感膜電極能夠對核酸適體進行間接電位檢測[11,13]。

聚離子敏感膜電極由Meyerhoff課題組首先提出[14-15]，其原理是聚離子在離子對協助作用下發(fā)生相界面轉移，并產生類穩(wěn)態(tài)的電位響應[16-17]。Bakker課題組發(fā)展了可逆的聚陽離子敏感膜電極，利用脈沖電流技術調控聚陽離子進入或離開敏感膜，實現了電極的循環(huán)使用[18]。最近，Meyerhoff課題組將基于脈沖電流調控的聚離子敏感膜電極作為流動注射檢測器，實現了對魚精蛋白和肝素等聚離子的連續(xù)檢測[19]。作者所在課題組也建立了基于恒電流調控主離子釋放的流動注射聚離子傳感模式，并應用于血液中肝素的連續(xù)檢測。目前，流動注射型聚離子傳感模式未見應用于對核酸適體及其目標物質的檢測。

本研究首次建立了以核酸適體作為識別分子、以聚離子敏感膜電極作為信號識別單元檢測ATP的流動注射分析方法。

1　實驗

1.1　試劑與儀器

三磷酸腺苷(ATP)、聚氯乙烯(PVC)、鄰硝基苯辛基醚(o-NPOE)、四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸銨(ETH 500)、二壬基萘磺酸(DNNS，50%庚烷溶液)、魚精蛋白、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma-Aldrich公司；四氫呋喃(THF)、濃鹽酸(HCl)、氯化鈉(NaCl)等，中國國藥集團。

核酸適體，其堿基序列如下：5′-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3′[13]，上海生物生工有限責任公司。

E2695型高效液相色譜儀，美國Waters；760 D型電化學工作站，上海辰華；PHSJ-3F型雷磁pH計，上海精科；CASCADE-BIO型超純水系統(tǒng)，美國頗爾；XS105DU型精密電子天平，梅特勒-托利多。

1.2　聚離子敏感膜電極的制備與活化

聚離子敏感膜電極的膜組分如下：12.0 mg DNNS、12.0 mg ETH 500、60.0 mg PVC、122.0 mgo-NPOE。將稱好的膜組分溶于3.0 mL THF中并攪拌2 h，倒入直徑3.6 cm并固定于玻璃板上的玻璃圓環(huán)中，室溫下揮干THF成膜。用打孔器將膜切割成直徑6.0 mm的小圓片，并用THF粘在PVC管的末端，得到聚離子敏感膜電極。

電極內充液與活化液為含有50 μg·mL-1魚精蛋白的Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol·L-1Tris，pH=7.4，1 mmol·L-1NaCl,下同)，電極需在活化液中活化12 h后使用；電極不用時于4 ℃下保存。

1.3　核酸適體與ATP的作用

核酸適體使用前經95 ℃加熱5 min，然后置于冰上10 min，以保證其構象的柔韌性[20]。將2.0 μmol·L-1核酸適體與一定濃度的ATP于37 ℃孵育30 min，孵育過程中需不斷攪拌，以促進核酸適體與ATP的作用。

1.4　電位檢測

采用流動注射分析與電位法相結合的手段，將電位檢測裝置固定于流動分析系統(tǒng)中。檢測系統(tǒng)包括載流系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)和電位檢測系統(tǒng)。其中，載流系統(tǒng)和進樣系統(tǒng)由高效液相色譜儀實現；電位檢測系統(tǒng)(圖1)由噴壁式流通池、電化學工作站和三電極體系(工作電極為聚離子敏感膜電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑絲電極)構成；載液經載流系統(tǒng)進入流通池，樣品溶液經進樣系統(tǒng)進入流通池；載液為Tris-HCl緩沖溶液，樣品溶液為含有一定濃度核酸適體或其與ATP的復合物的Tris-HCl緩沖溶液，載液與樣品溶液流出流通池后即為廢液。電位檢測采用計時電位模式，設置陽極電流為10 nA，初始極性為陽性。

圖1　電位檢測系統(tǒng)示意圖

2　結果與討論

2.1　電位檢測原理

經魚精蛋白活化后的聚離子敏感膜電極，在施加恒定陽極電流條件下，電極外界面處的魚精蛋白會產生一個穩(wěn)定的由膜相到溶液相的主離子通量，使電極表面魚精蛋白含量維持在恒定水平，從而得到穩(wěn)定的基線電位；當分析物(如核酸適體)進入檢測池，與電極表面的魚精蛋白發(fā)生作用并形成穩(wěn)定的復合物，界面處主離子濃度的減少會促使溶液相中的Na+進入膜相，引起電極電位的變化；當分析物流出檢測池后，在陽極電流的作用下，電極表面被消耗的主離子迅速得到補充，使電極電位恢復初始狀態(tài)，實現電極的在線更新與循環(huán)使用。

若核酸適體先與其目標物質(如ATP)作用形成復合物，以復合物形式存在的核酸適體進入檢測池后不再與魚精蛋白發(fā)生相互作用，使峰電位(Eh)值降低，可以實現對目標物質的檢測。

2.2　檢測條件的選擇

以2.0 μmol·L-1核酸適體為檢測對象，對流動注射分析方法的檢測條件進行優(yōu)化。

2.2.1電流對電極性能的影響(圖2)

圖2　電流對電位響應的影響

零電流條件下，魚精蛋白由內充液擴散至聚離子敏感膜表面的速率較慢，使敏感膜表面的魚精蛋白含量降低；外加電流的作用能夠促進魚精蛋白在敏感膜內的遷移，使魚精蛋白在敏感膜表面的含量增加，從而產生更大的峰電位；由于聚離子敏感膜電極的電位響應校準曲線呈S形，當敏感膜表面的魚精蛋白含量超出一定濃度范圍后，電極變得不靈敏，對低濃度待測物質響應較小。由圖2可知，在10 nA電流下，電極表現出最佳的響應性能。因此，電流選用10 nA。

2.2.2載液流速對電極性能的影響(圖3)

圖3　載液流速對電位響應的影響

由圖3可知，隨著載液流速的加快，峰電位值升高。這是因為，載液流速加快，水相中以及水-膜界面處聚離子遷移速率加快，促進魚精蛋白與核酸適體的作用，從而產生較大的峰電位；當流速超過2.0 mL·min-1時，核酸適體與魚精蛋白的作用時間縮短，使得峰電位值降低。因此，載液流速選用2.0 mL·min-1。

2.2.3進樣量對電極性能的影響(圖4)

由圖4可知，隨著進樣量的增加，峰電位值升高。這是因為，進樣量增加，敏感膜界面處被消耗的魚精蛋白量增加，從而引起峰電位值升高；當進樣量達到80 μL后，魚精蛋白的消耗量達到飽和，峰電位值不再升高。因此，進樣量選用80 μL。

圖4　進樣量對電位響應的影響

2.3　電極對核酸適體的連續(xù)檢測

在電流10 nA、載液流速2.0 mL·min-1、進樣量80 μL的優(yōu)化條件下，電極對不同濃度的核酸適體的電位檢測結果如圖5所示。圖中EMF 表示電極電位值，Eh表示電極電位變化值(即峰高)，ΔEh表示待測物所引起的電極電位峰高值與背景溶液所引起的電極電位峰高值之差，即扣除背景溶液影響后的峰高值。

圖5不同濃度(μmol·L-1)的核酸適體的電位響應

Fig.5Potentialresponsestoaptameratdifferentconcentrations(μmol·L-1)

由圖5可知，在0.2～4.0 μmol·L-1濃度范圍內，電極峰電位變化值與核酸適體濃度呈良好的線性關系，線性方程為：△Eh=0.32+5.13c(其中△Eh表示峰電位變化值，mV；c表示核酸適體的濃度，μmol·L-1)，相關系數R2=0.9720。本方法對2.0 μmol·L-1核酸適體進行測定的相對標準偏差為1.9%(n=5)。

2.4　電極檢測ATP的工作曲線

以2.0 μmol·L-1核酸適體為指示分子，對不同濃度的ATP進行檢測，結果見圖6。

由圖6可知，在2.0～12.0 μmol·L-1濃度范圍內，電極峰電位變化值與ATP濃度呈良好的線性關系，其線性方程為：ΔEh=0.90+0.44c(其中ΔEh表示峰電位變化值，mV；c表示ATP樣品濃度，μmol·L-1)，相關系數R2=0.9687。此時，電極的檢出限為1.4 μmol·L-1。本方法對8.0 μmol·L-1ATP進行測定的相對標準偏差為6.3%(n=5)。

圖6不同濃度(μmol·L-1)的ATP的電位響應

Fig.6PotentialresponsestoATPatdifferentconcentrations(μmol·L-1)

3　結論

提出了一種檢測ATP的流動注射分析方法。經魚精蛋白活化的聚離子敏感膜電極被放置在流動分析系統(tǒng)中，可對核酸適體及其目標物質進行電位檢測；外加陽極電流能夠促進電極表面所消耗的魚精蛋白的補充，使電極能夠快速恢復。本方法的選擇性依賴于核酸適體對目標物質的選擇性，使用不同的核酸適體作為識別分子，可以實現對不同目標物質的檢測。在電流為10 nA、載液流速為2.0 mL·min-1、進樣量為80 μL的優(yōu)化條件下，本方法對ATP檢測的線性范圍為2.0～12.0 μmol·L-1，檢出限為1.4 μmol·L-1。本方法亦可應用于其它聚陰離子(如肝素、透明質酸鈉等)的檢測。

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