硒化卡拉膠寡糖的制備及其抑制血管生成作用研究

吳海歌

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

硒是生命活動(dòng)的必需元素[1]，在人類(lèi)防癌、抗癌、延緩衰老、提高機(jī)體免疫力、預(yù)防治療心血管疾病、治療克山病和大骨節(jié)病等方面都發(fā)揮了重要作用[2-4]。硒的存在形式有無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，常見(jiàn)的無(wú)機(jī)硒有亞硒酸鈉和硒酸鈉等，其活性和毒性范圍較窄，生理活性低、毒性大，并具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時(shí)劑量難以控制。而有機(jī)硒具有毒性低、副作用小的特性，能夠更好地發(fā)揮硒的多種生理活性。有機(jī)硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有有機(jī)硒的多種活性，而且還具有多糖的各種生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被機(jī)體吸收利用[5]。因此，近年來(lái)對(duì)硒多糖的研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　材料與試劑

卡拉膠，江蘇常航膠體科技有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，ATCC公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司；小牛血清，杭州四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，GibcoBRL公司。

其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2　方法

1.2.1硒化卡拉膠寡糖的制備

在酸性條件下，將亞硒酸鈉、硫酸與卡拉膠進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液減壓濃縮并通過(guò)截留分子量為500的透析袋透析48 h，再經(jīng)乙醇沉淀、冷凍干燥，得純化的硒化卡拉膠寡糖。設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)硒化反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高產(chǎn)物中的硒含量。

1.2.2硒化卡拉膠寡糖硒含量的測(cè)定

采用原子吸收法[9]測(cè)定硒化卡拉膠寡糖硒含量。稱(chēng)取50 mg硒化卡拉膠寡糖樣品，用1%HNO3溶解，加入1 mL Ni(OAc)2基體改良劑，然后用1%HNO3定容至10 mL(樣品濃度為5 mg·mL-1)。分別取樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液的硒濃度。硒化卡拉膠寡糖硒含量為所測(cè)樣品溶液的硒濃度/樣品濃度。

1.2.3硒化卡拉膠寡糖的薄層分析(TLC)

對(duì)硒化卡拉膠寡糖、乳糖和卡拉膠進(jìn)行薄層分析，展開(kāi)劑為正丁醇-乙酸-H2O(體積比為2∶2∶1)。顯色劑為苯胺、二苯胺、磷酸和丙酮。

1.2.4硒化卡拉膠寡糖的紫外光譜分析

將微量的亞硒酸鈉、卡拉膠、卡拉膠寡糖和硒化卡拉膠寡糖溶于水中，在紫外光譜儀上進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5硒化卡拉膠寡糖對(duì)雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用

雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。將受精的雞蛋在37 ℃濕潤(rùn)環(huán)境下孵育6 d，第7 d后用75%的乙醇將雞蛋氣室端消毒后，小心開(kāi)啟1 cm2的小孔，分別將蘸滿50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1硒化卡拉膠寡糖或PBS溶液(陰性對(duì)照)的明膠放置在氣孔中的雞胚尿囊膜上，封好小孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在解剖鏡下觀察雞胚尿囊膜血管生成情況。

1.2.6硒化卡拉膠寡糖對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)硒化卡拉膠寡糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。首先在培養(yǎng)板中接種2×105個(gè)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成密集單層后，以0.5 mm的橡皮刮劃過(guò)細(xì)胞單層，用PBS溶液沖洗2遍，分別加入硒化卡拉膠寡糖和PBS溶液(陰性對(duì)照)，硒化卡拉膠寡糖的終濃度分別為50μg·mL-1、100μg·mL-1和200μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的效果。

1.2.7硒化卡拉膠寡糖對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分化成管的影響

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分化成管實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行并適當(dāng)改進(jìn)。首先將5 mg·mL-1的膠原鋪到96孔板底，在37 ℃下放置20 min后每孔接種2×104個(gè)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別加入PBS溶液(陰性對(duì)照)和終濃度分別為50μg·mL-1、100μg·mL-1和200μg·mL-1的硒化卡拉膠寡糖，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞成管的狀態(tài)。

2　結(jié)果與討論

2.1　硒化卡拉膠寡糖的制備與表征

在酸性條件下，卡拉膠不僅能夠與亞硒酸鈉發(fā)生反應(yīng)生成硒化卡拉膠，而且能夠通過(guò)酸性水解作用最終形成硒化卡拉膠寡糖。純化后的硒化卡拉膠寡糖為粉色粉末狀固體，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。首次制得的硒化卡拉膠寡糖硒含量為21μg·mg-1，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件后制得的硒化卡拉膠寡糖硒含量達(dá)到30μg·mg-1，平均分子量為1.43 kDa。

乳糖、硒化卡拉膠寡糖和卡拉膠的薄層層析結(jié)果如圖1所示，卡拉膠、卡拉膠寡糖、亞硒酸鈉、硒化卡拉膠寡糖的紫外光譜見(jiàn)圖2。

圖1　乳糖(a)、硒化卡拉膠寡糖(b)、卡拉膠(c)的薄層層析結(jié)果

圖2　卡拉膠(a)、卡拉膠寡糖(b)、 亞硒酸鈉(c)、硒化卡拉膠寡糖(d)的紫外光譜

由圖1可以看出，硒化卡拉膠寡糖在硅膠板上的遷移率介于乳糖和卡拉膠之間，并且更接近乳糖，說(shuō)明制備的產(chǎn)物為寡糖。

由圖2可以看出，卡拉膠和卡拉膠寡糖在190～300 nm都沒(méi)有紫外吸收峰，亞硒酸鈉在200～210 nm之間有明顯的吸收峰，硒化卡拉膠寡糖與亞硒酸鈉在相同波長(zhǎng)處出現(xiàn)明顯的吸收峰，說(shuō)明亞硒酸根已經(jīng)連接到卡拉膠寡糖上，確證產(chǎn)物為硒化卡拉膠寡糖。

2.2　硒化卡拉膠寡糖對(duì)雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用(圖3)

a.陰性對(duì)照b～d.硒化卡拉膠寡糖濃度(μg·mL-1):50,100,200

圖3硒化卡拉膠寡糖對(duì)雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用

Fig.3Anti-angiogenicactivityofseleno-carrageenanoligosaccharideonchickenchorioallantoicmembrane

雞胚尿囊膜是檢驗(yàn)藥物抑制血管生成的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。由圖3a可以看出，雞胚在孵化過(guò)程中生出正常的樹(shù)枝狀血管；以不同濃度硒化卡拉膠寡糖處理后發(fā)現(xiàn)，硒化卡拉膠寡糖能夠明顯抑制雞胚尿囊膜的血管生成，在施藥部位沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大的血管生成;50μg·mL-1和100μg·mL-1劑量組施藥部位隱約可見(jiàn)一些微小的血管(圖3b、3c)，而200μg·mL-1劑量組施藥部位沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微小的血管，表明硒化卡拉膠寡糖在50～200μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)抑制雞胚尿囊膜血管生成作用與濃度正相關(guān)。

2.3　硒化卡拉膠寡糖對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響(圖4)

a.血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕后　b.陰性對(duì)照　c～e.硒化卡拉膠寡糖濃度(μg·mL-1)∶50，100，200

血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是血管生成的關(guān)鍵生理步驟之一，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是抑制血管生成的有效靶點(diǎn)之一[12]。由圖4b可以看出，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用很強(qiáng)，24 h后劃痕幾乎愈合；由圖4c、4d、4e可以看出，不同濃度的硒化卡拉膠寡糖能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，在50～200μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，抑制作用與濃度正相關(guān)，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能夠有效地抑制血管的生成，暗示了硒化卡拉膠寡糖能夠通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移而抑制血管的生成。

2.4　硒化卡拉膠寡糖對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分化成管的影響(圖5)

a.陰性對(duì)照　b～d.硒化卡拉膠寡糖濃度(μg·mL-1)∶50，100，200

血管內(nèi)皮細(xì)胞分化成管狀結(jié)構(gòu)是決定血管生成的關(guān)鍵因素之一，如果血管內(nèi)皮細(xì)胞不能分化為管狀結(jié)構(gòu)，那么新生血管將不能正常形成[12]。由圖5a可以看出，在膠原上三維立體培養(yǎng)可以顯著誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，細(xì)胞形成很長(zhǎng)的偽足，偽足之間相互聯(lián)系形成管狀的結(jié)構(gòu)；由圖5b、5c、5d可以看出，經(jīng)50μg·mL-1硒化卡拉膠寡糖處理后，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞伸出的偽足變少、變短，成管現(xiàn)象減弱；經(jīng)100μg·mL-1和200μg·mL-1硒化卡拉膠寡糖處理后，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞變成長(zhǎng)梭形或橢圓形，幾乎看不到較長(zhǎng)的偽足。表明硒化卡拉膠寡糖具有抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分化成管的作用，在50～200μg·mL-1范圍內(nèi)，抑制作用與濃度正相關(guān)，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。暗示了硒化卡拉膠寡糖能夠通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞分化而抑制血管的生成。

3　結(jié)論

在酸性條件下，以亞硒酸鈉與卡拉膠反應(yīng)制備硒化卡拉膠寡糖，硒含量達(dá)到30μg·mg-1。雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硒化卡拉膠寡糖具有抑制血管生成作用；人臍靜脈血管內(nèi)皮劃痕實(shí)驗(yàn)和分化成管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硒化卡拉膠寡糖能夠明顯地抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和分化，而且這種抑制作用在50～200μg·mL-1的范圍內(nèi)與濃度正相關(guān)，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。暗示硒化卡拉膠寡糖可能是通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和分化從而抑制血管的生成。血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要的作用，抑制腫瘤血管生成可以有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7-8]，硒化卡拉膠寡糖表現(xiàn)出良好的血管生成抑制作用，預(yù)示其在腫瘤血管生成抑制方面具有應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]BIRRINGER M，PILAWA S，F(xiàn)LOHE L.Trends in selenium bio-chemistry[J].Natural Product Reports,2002,19(6):693-718.

[2]IP C,DONG Y,GANTHER H E.New concepts in selenium chemoprevention[J].Cancer and Metastasis Reviews,2002,21(3):281-289.

[3]XU X M,CARLSON B A,GRIMM T A,et al.Rhesus monkey simian immunod eficiency virus infection as a model for assessing the role of selenium in AIDS[J].Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes,2002,31(5):453-463.

[4]TAN J A,ZHU W Y,WANG W Y,et al.Selenium in soil and endemic diseases in China[J].Science of the Total Environment,2002,284:227-235.

[5]黃峙,鄭文杰,郭寶江.含硒生物大分子化合物研究進(jìn)展[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,19(2):169-175.

[6]王長(zhǎng)云，顧謙群，周鵬，等.紅藻多糖卡拉膠分子修飾研究Ⅰ.酸降解[J].中國(guó)海洋藥物,2003，(2)：24-27.

[7]MACKEY J R,KERBEL R S,GELMON K A,et al.Controlling angiogenesis in breast cancer:A systematic review of anti-angiogenic trials[J].Cancer Treatment Review,2012,38(6):673-688.

[8]NORDEN A D,DRAPPATZ J,WEN P Y.Novel anti-angiogenic therapies for malignant gliomas[J].Lancet Neurol,2008,7(12):1152-1160.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1995：附錄32-33.

[10]ZHAO J,MIAO J Y,ZHAO B X,et al.Safrole oxide inhibits angiogenesis by inducing apoptosis[J].Vascular Pharmacology,2005,43(1):69-74.

[11]JONES M K,WANG H,PESKAR B M,et al.Inhibition of angiogenesis by nonsteroidal anti-inflammatory drugs:Insight into mechanisms and implications for cancer growth and ulcer healing[J].Nature Medicine,1999,5(12):1418-1423.

[12]COULTAS L,CHAWENGSAKSOPHAK K,ROSSANT J.Endothelial cells and VEGF in vascular development[J].Nature,2005,438(7070):937-945.