布魯氏菌病血清學(xué)Brucellacapt和iELISA檢測方法的比較

趙 娜，趙赤鴻，榮 蓉，肖 培，孫 巖,3，王 娜,3，崔步云

布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌感染引起的人畜共患的傳染—變態(tài)反應(yīng)性疾病，近年來我國及全球范圍內(nèi)布魯氏菌病呈現(xiàn)較高的發(fā)病率[1-2]。人感染布魯氏菌病后的主要癥狀為長期發(fā)熱、伴有多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等，但是布病的臨床癥狀往往缺乏特異性，易誤診貽誤治療[3]。因此，布魯氏菌病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，對于布病患者來說尤為重要。

血清學(xué)檢測方法由于其快速和高效等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于布魯氏菌病的檢測和診斷。現(xiàn)在常用診斷布病的血清學(xué)方法是虎紅平板凝集試驗(RBPT)和試管凝集試驗(SAT)[4]，我國從上世紀(jì)80年代就有ELISA方法在布病診斷方面的研究[5]，iELISA作為一種相對較新的血清學(xué)診斷技術(shù)，在國際上已經(jīng)成為公認(rèn)的成熟技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于人畜布病診斷[6]。近年來，一種新的布魯氏菌血清學(xué)診斷技術(shù)—Brucellacapt已在部分國家應(yīng)用，顯示出較高的靈敏度和特異度[7-8]。

本文就2013年在內(nèi)蒙古布魯氏菌病門診就診的疑似布魯氏菌病的人，在RBPT和SAT確證以及治療以后，對其保存血清使用Brucellacapt方法與iELISA方法進行血清學(xué)檢測，從操作以及檢測結(jié)果兩方面，對比兩者檢測方法的差異，探討其在布病診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1病人確診 根據(jù)我國《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS269—2007)：流行病學(xué)接觸史、臨床癥狀和RBPT法陽性以及SAT滴度為1∶100(++)及以上，滿足以上三項條件者為布病病人。

1.2主要試劑及試劑盒 布魯氏菌病虎紅平板凝集抗原、布魯氏菌病試管凝集抗原為中國CDC制備。iELISA試劑盒為德國IBL公司生產(chǎn)，批號：BRG-221；Brucellacapt試劑盒為西班牙Vircell公司的產(chǎn)品，批號:13BRU401 。

1.3主要儀器 酶標(biāo)儀(BIO-RAD 680)、恒溫箱、試管架、移液器、刻度吸管等，洗板采用手工洗板的方法。

1.4試驗方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1RBPT 試驗方法及判定標(biāo)準(zhǔn)按照說明書進行。受檢者血清在4 min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判定為陽性(+)，無凝集現(xiàn)象呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。

1.4.2SAT 試驗方法及判定標(biāo)準(zhǔn)參照我國《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS269—2007)。

1.4.3iELISA 試驗步驟嚴(yán)格按照說明書，該反應(yīng)產(chǎn)生有顏色產(chǎn)物，使用酶標(biāo)儀在450nm波長測定反應(yīng)孔的OD值，在截斷值之上的判為陽性(+)，截斷值之下的判為陰性(-)，IgG及IgM的檢測結(jié)果任何一項為陽性者，則判斷為iELISA實驗結(jié)果為陽性(+)。

1.4.4Brucellacapt 按照說明說進行試驗操作，滴度為1/320及以上陽性判為陽性(+)，否則為陰性(-)。

1.5統(tǒng)計分析方法 試驗結(jié)果使用Excel進行錄入，對全部結(jié)果應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié) 果

用上述方法對全部120份血清樣品進行了檢測，檢測結(jié)果見表1，使用統(tǒng)計軟件分析兩種檢測方法的評價指標(biāo)，結(jié)果見表2。

表1 布病患者診斷及兩者血清學(xué)檢測結(jié)果

表2 兩種檢測方法評價指標(biāo)分析結(jié)果

從表1可以看出，使用Brucellacapt的方法對120份血清樣本檢測，其陽性數(shù)為67，iELISA方法檢測的陽性數(shù)為84。

從表2可以看出，Brucellacapt和iELISA檢測方法對于同一批樣品，其檢測的符合率均較高，分別為85.0%和80.8%。但是兩者的靈敏度和特異度差別較大，Brucellacapt方法的靈敏度和特異度分別為82.7%和88.9%，而iELISA檢測方法的靈敏度和特異度分別為90.7%和64.4%。Kappa值和ROC(receive operating characteristics curve，受試者工作特征曲線)曲線下面積方面，Brucellacapt方法分別為0.69、0.86，iELISA方法的結(jié)果分別為0.57、0.78。

3 討 論

本次研究在納入病例時，在嚴(yán)格遵照我國《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS269—2007)基礎(chǔ)上，使用RBPT和SAT進行血清學(xué)檢查，結(jié)合詳細流行病學(xué)個案調(diào)查，包括疑似病人的臨床癥狀，流行病學(xué)接觸史等內(nèi)容，綜合判斷。并對確診病人進行布病治療，療程結(jié)束后，再次對病人的進行隨訪，若治療有效病情好轉(zhuǎn)則確定其為布病病人，納入為病例組，其他全部列為對照組。本方法保證了病例組和對照組選取的客觀性和準(zhǔn)確性。

試驗結(jié)果真實性的評價指標(biāo)為靈敏度和特異度，靈敏度越高反映該試驗發(fā)現(xiàn)病人的能力越強，特異度反映的是試驗確定非病人的能力?？煽啃缘脑u價指標(biāo)是符合率和Kappa值，這兩個指標(biāo)可以反映試驗判定的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果的一致性[9]。本文對75例布魯氏菌病病人和45例非布魯氏菌病病人的檢測分析表明，iELISA方法的靈敏度高于Brucellacapt方法，其檢測出病人的能力較強，而Brucellacapt方法的特異度要明顯高于iELISA方法，其檢測出非病人的能力較好，本次實驗的結(jié)果與Ozdemir等人[8]的報道一致。但是從符合率和Kappa值上，Brucellacapt方法均高于iELISA方法，這兩項指標(biāo)的結(jié)果可反映出，Brucellacapt比iELISA方法檢測結(jié)果的可靠性更高。

ROC曲線是評價檢驗試驗的一種全面、準(zhǔn)確、有效的方法，曲線下面積反映了診斷試驗價值的大小，面積越大，越接近1.0，診斷的真實度越高[9]，本次實驗的結(jié)果顯示Brucellacapt方法與iELISA方法ROC曲線下面積分別為0.86和0.78，均有一定的診斷價值。

目前部分國外學(xué)者對該方法的研究結(jié)果[10-11]，與本實驗室的研究結(jié)果不同，其原因主要是在病例納入時選定的標(biāo)準(zhǔn)不同，本實驗選取的患者不僅按照中國的診斷標(biāo)準(zhǔn)檢測，同時做了個案調(diào)查，了解了每一位病人的情況。

Brucellacapt檢測方法操作簡便，和iELISA方法相比無需其他儀器，且無洗板過程，可以降低樣品之間的污染。Brucellacapt檢測方法是一種基于雙抗體夾心ELISA方法為原理的一種免疫捕獲凝集試驗(immuncapture agglutination test)，檢測標(biāo)志物是IgM、IgG、IgA抗體，同時也能夠檢測出不完全抗體，但是無法區(qū)分出是哪種抗體類型[7,12]。iELISA方法能夠檢測出布魯氏菌的IgG和IgM抗體類型，進而分析病人所處的發(fā)病時期[13]。

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