牛源大腸桿菌O157∶H7的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

程慧芳，寇亞楠，陳雅君，劉中原，張龍現(xiàn),2，王亞賓，陳麗穎，胡 慧,2

腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli) O157∶H7是一種重要的人獸共患傳染病病原菌。感染該菌可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis，HC)，此外還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，致死率達(dá)5%～10%[1-2]。

自1982年美國(guó)首次暴發(fā)了由大腸桿菌O157∶H7引起的出血性腸炎以來(lái)，加拿大、英國(guó)、日本等國(guó)也相繼報(bào)道了大腸桿菌O157∶H7的爆發(fā)和流行[3]；我國(guó)也陸續(xù)有多個(gè)省份在食品、家禽、家畜、昆蟲、腹瀉病患者中檢出該致病菌[4-5]，腸出血性大腸桿菌O157∶H7的感染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

大腸桿菌O157∶H7是一種以食物為主要傳播途徑的致病菌，牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要宿主[3,6]，該菌感染后可從動(dòng)物傳染給人，也可由人傳染給人而引起感染；同時(shí)也可以通過(guò)食物、水源而間接的傳染給人[7]。我國(guó)于1987年首次從出血性結(jié)腸炎病人糞便中分離到大腸桿菌O157∶H7，此后多個(gè)省也都陸續(xù)有報(bào)道從市售食品、進(jìn)口食品、家畜家禽、腹瀉患者糞便中分離到該菌。因此，對(duì)動(dòng)物源性大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行快速檢測(cè)方法的研究、流行病學(xué)調(diào)查、生物學(xué)特性研究以及遺傳變異研究就顯得尤為重要，是及時(shí)有效地防控大腸桿菌O157∶H7感染流行的關(guān)鍵步驟。

為了解大腸桿菌O157∶H7在牛群中的流行及其病原學(xué)特性，本試驗(yàn)從鄭州地區(qū)牛場(chǎng)采集糞便及牛奶樣品共146份，對(duì)大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，為動(dòng)物源大腸桿菌O157∶H7流行病學(xué)研究提供了資料，也為大腸桿菌O157∶H7的防控奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣品采集 取自鄭州地區(qū)3個(gè)不同奶牛場(chǎng)健康成年泌乳奶牛排出的新鮮糞便及鮮牛奶。每份新鮮糞便樣品分別裝入一次性的自封袋內(nèi)；生鮮牛奶直接裝入滅菌試管。所有的樣品均放于低溫冰盒中，24 h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室，每批樣品均統(tǒng)一處理。

1.2菌種 大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43895由河南省動(dòng)物源性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；所用菌株均用30%甘油保存在-70 ℃。

1.3主要試劑與儀器 大腸桿菌O157∶H7選擇性培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司； 2×PCR TaqMix購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司；微量生化鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。PCR儀(Bio-rad，PTC-200 PCR擴(kuò)增儀，USA)紫外凝膠成像儀(美國(guó)ALPHA INNOTECH)；紫外分析儀天UV-2000(天能科技上海有限公司)。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank公布的EHEC O157∶H7的rfbE基因(參考序列S83460)、fliC基因(參考序列AF228488)、hlyA基因(參考序列EU118026.1)序列和文獻(xiàn)報(bào)道的Stx2基因、eaeA基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)出符合多重PCR要求的5對(duì)引物。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。各引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.5大腸桿菌O157∶H7分離、鑒定 按常規(guī)方法將樣品經(jīng)預(yù)增菌處理后[10]，接種于大腸桿菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基上，篩選純化出疑似大腸桿菌O157∶H7菌株，然后應(yīng)用本試驗(yàn)室已建立的大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法對(duì)疑似菌株進(jìn)行鑒定。

1.6大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的生物學(xué)特性研究

1.6.1生化試驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的紅色菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h ，按常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn)，主要包括吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、糖類發(fā)酵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)以及檸檬酸鹽試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、丙二酸鹽試驗(yàn)等。

1.6.2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與繪制 使用分光光度計(jì)測(cè)定大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株的OD600值。每隔0.5 h測(cè)量1次，并對(duì)濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其OD600值在0.50～1.00以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測(cè)得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實(shí)際的OD值。重復(fù)測(cè)定3次，以上述各個(gè)測(cè)定點(diǎn)的時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌O157∶H7的生長(zhǎng)曲線。

1.6.3生物被膜的形成 采用試管法和玻片法兩種方法。

1.6.3.1試管法 將菌液于無(wú)菌條件下接種于液體LB中，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。分別于8、24、36、48和72 h時(shí)取出試管，將試管中液體棄去，用PBS漂洗3次，甲醇固定1 min，棄去，加入結(jié)晶紫染色15 min，吸取試管中多余的結(jié)晶紫染色液后，在自來(lái)水下沖洗試管3～5 min，把試管倒置在濾紙上除去過(guò)多的水，并在37 ℃烘箱中烘干，觀察，記錄。

1.6.3.2玻片法 菌液用LB培養(yǎng)基1∶200稀釋, 取3 mL置6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入無(wú)菌蓋玻片，37 ℃培養(yǎng)，每24 h換液一次。分別于第8、24、36、48和72 h取出蓋玻片，PBS漂洗3次，除去浮游細(xì)菌，用10%甲醇將細(xì)菌固定15 min，結(jié)晶紫染色5 min，自來(lái)水沖去多余染色液，晾干后，用樹膠將蓋玻片粘到載玻片上，鏡檢。

1.7大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的毒力基因檢測(cè) 為了解分離的2株大腸桿菌O157∶H7攜帶毒力基因的情況，針對(duì)大腸桿菌O157∶H7的細(xì)胞溶血素hlyA基因、志賀菌素stx2基因以及黏附基因eaeA設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室已建立的多重PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)與分析[11]。

2 結(jié) 果

2.1大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的分離鑒定 采集的樣品經(jīng)初步增菌培養(yǎng)，在麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后經(jīng)大腸桿菌O157∶H7選擇性培養(yǎng)基初步分離后，再經(jīng)多重PCR對(duì)其鑒定。結(jié)果表明本次從牛場(chǎng)采集的樣品，共分離到2株大腸桿菌O157∶H7，分別命名為L(zhǎng)1和L2，其檢出率為1.4%。PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1大腸桿菌O157∶H7PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.1ResultsofPCRtodetecttheEscherichiacoliO157∶H7isolates

M: DL2000 DNA marker; +: Positive control;-: Negative control; 1: L1 isolate; 2: L2.

2.2大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1生化試驗(yàn)結(jié)果 大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：靛基質(zhì)陽(yáng)性，V-P陰性，不利用檸檬酸鹽，不產(chǎn)H2S等，3株菌所得結(jié)果均相同，均符合大腸桿菌的常規(guī)生化特性。另外，尿素酶試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、部分糖類的發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果有一定差異，試驗(yàn)中3株菌均發(fā)酵山梨醇并產(chǎn)氣，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)大腸桿菌O157∶H7不同。具體的生化特性見(jiàn)表2。

2.2.2大腸桿菌O157∶H7生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與繪制 使用754紫外分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌的OD600值，將同時(shí)接種的菌液每隔0.5 h測(cè)定1次，根據(jù)OD值測(cè)定結(jié)果繪制出生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖2所示。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，大腸桿菌O157∶H7 臨床分離株L1和L2進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間較早，進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間也較早。L1和L2菌株的生長(zhǎng)曲線比較一致。

圖2大腸桿菌O157∶H7在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

Fig.2GrowthcurveofEscherichiacoliO157∶H7inLBculturemedium

表2 大腸桿菌O157∶H7各項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果

Note: “⊕” shows producing acid and gas; “+” shows yielding acid; “-” shows negative reaction.

2.2.3大腸桿菌O157∶H7生物被膜形成的結(jié)果

2.2.3.1試管法 利用玻璃試管法直觀在試管壁上觀察生物被膜，可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)株接種后24 h細(xì)菌開(kāi)始粘附于試管壁，36 h形成完整的被膜，48 h后細(xì)菌開(kāi)始脫落。臨床分離株L1接種后36 h細(xì)菌開(kāi)始明顯的粘附于試管壁，48 h形成完整的被膜，72 h后細(xì)菌開(kāi)始脫落。臨床分離株L2接種后24 h細(xì)菌開(kāi)始大量粘附于試管壁，36 h形成完整的被膜，48 h后細(xì)菌開(kāi)始脫落。

2.2.3.2玻片法 應(yīng)用玻片法觀察生物被膜的形成(見(jiàn)圖3A-C)，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜在24 h處于細(xì)菌起始粘附過(guò)程，可觀察到少量細(xì)菌開(kāi)始粘附于載體上；至36 h已經(jīng)形成成熟完整生物被膜，大量微菌落連成片狀；48 h后微菌落減少，生物被膜開(kāi)始脫落，結(jié)果如圖3(A)。臨床分離株L1生物被膜在24 h處于細(xì)菌起始粘附過(guò)程，可觀察到少量細(xì)菌開(kāi)始粘附于載體上；至48 h已經(jīng)形成成熟完整生物被膜，大量微菌落連成片狀；72 h后微菌落減少，生物被膜開(kāi)始脫落，結(jié)果如圖3(B)。臨床分離株L2生物被膜在24 h處于細(xì)菌起始粘附過(guò)程，可觀察到少量細(xì)菌開(kāi)始粘附于載體上；至36 h已經(jīng)形成成熟完整生物被膜，大量微菌落連成片狀；48 h后微菌落減少，生物被膜開(kāi)始脫落，結(jié)果如圖3(C)。

2.3大腸桿菌O157∶H7臨床分離株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)2株大腸桿菌O157∶H7臨床分離株攜帶的毒力基因(rfbE基因、fliC基因、hlyA基因、eaeA基因和stx2基因)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，多重PCR檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖4)：2株菌株均攜帶有hlyA基因和eaeA基因, L1攜帶Stx2基因。

3 討 論

腸出血性大腸桿菌O157∶H7感染性腹瀉是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，主要通過(guò)食物傳播，牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要宿主，其中以牛的帶菌率最高，而且牛一旦感染這種細(xì)菌，排菌時(shí)間至少為1年。有報(bào)道稱人感染10個(gè)活菌可致病，因此，加強(qiáng)動(dòng)物源性大腸桿菌O157∶H7的流行病學(xué)調(diào)查對(duì)該病的防治具有重大意義。為了解鄭州地區(qū)牛攜帶大腸桿菌 O157∶H7的情況，收集糞便和新鮮牛奶共146份，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室已建立的大腸桿菌 O157∶H7多重PCR方法對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，共分離出2株大腸桿菌 O157∶H7，進(jìn)一步對(duì)臨床分離的動(dòng)物源大腸桿菌O157∶H7的生物學(xué)特性以及攜帶的毒力基因情況進(jìn)行了檢測(cè)分析，為大腸桿菌O157的流行病學(xué)調(diào)查研究奠定基礎(chǔ)。

圖3(A) 動(dòng)物源大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜形成(400×)

圖3(B) 動(dòng)物源大腸桿菌O157∶H7臨床分離株L1生物被膜形成(400×)

圖4大腸桿菌O157∶H7毒力基因的多重PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.4ResultsofmultiplexPCRtodetectthevirulencegenesoftheEscherichiacoliO157∶H7isolates

M: DL2000 DNA marker; +: Positive control;-: Negative control; 1: L1 isolate; 2: L2 isolate.

3.1生化試驗(yàn) 細(xì)菌生化試驗(yàn)是細(xì)菌生物學(xué)特性中的重要一環(huán)，通過(guò)生化試驗(yàn)可以初步鑒別不同菌株的差異。尿素酶、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)，乳糖、蔗糖、L-阿拉伯糖和木糖這些糖類發(fā)酵試驗(yàn)大腸桿菌O157∶H7的3株菌之間均有差異，這可能與菌株來(lái)源和攜帶毒力因子有一定關(guān)系，從而表現(xiàn)出一定的差異，為進(jìn)一步研究提供了初步依據(jù)。

許多文獻(xiàn)報(bào)道大腸桿菌O157∶H7均為山梨醇陰性或遲緩陽(yáng)性，本生化試驗(yàn)中山梨醇試驗(yàn)O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株均為陽(yáng)性并產(chǎn)氣，根據(jù)這一特性，可以選用山梨醇麥康凱瓊脂鑒定其準(zhǔn)確性。2006年，范放等[12]分離到一株山梨醇陽(yáng)性菌株，2011年，張書蕭[13]研究中又分離到一株分解山梨醇的大腸桿菌O157∶H7菌株，因此在進(jìn)行大腸桿菌O157∶H7初篩時(shí)，需要慎重選擇培養(yǎng)基，在出現(xiàn)此類情況時(shí)應(yīng)反復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2生長(zhǎng)曲線 不同來(lái)源的細(xì)菌有其各自不同的生長(zhǎng)規(guī)律，同一種細(xì)菌不同的表現(xiàn)型也會(huì)有不同的生長(zhǎng)規(guī)律。大腸桿菌O157∶H7生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果表明，動(dòng)物源大腸桿菌O157∶H7臨床分離株L1、L2比標(biāo)準(zhǔn)株的遲緩期短，較早的進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)株生長(zhǎng)曲線的斜率小于臨床分離株L1、L2的斜率；大腸桿菌O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)株比臨床分離株L1、L2的穩(wěn)定期短。從而說(shuō)明攜帶不同毒力基因的動(dòng)物源性大腸桿菌O157∶H7之間的生長(zhǎng)曲線存在差異，不同來(lái)源的菌株及有無(wú)攜帶毒力因子的菌株生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)末期的不同，選擇合適的時(shí)間用于如小鼠灌毒試驗(yàn)、細(xì)胞粘附試驗(yàn)等試驗(yàn)的研究。

3.3生物被膜 生物被膜作為自然界中細(xì)菌主要的生存方式，給人類的生產(chǎn)生活帶來(lái)了嚴(yán)重危害。許多研究表明生物被膜中菌體表現(xiàn)出對(duì)抗生素的高度不敏感[14]，生物被膜一旦形成, 被膜深層細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性最高可達(dá)浮游細(xì)菌的1 000倍[15]，且成為潛在的感染源, 被膜向周圍環(huán)境緩慢釋放浮游菌, 引起反復(fù)性和難治性感染。本試驗(yàn)采用試管法和玻片法對(duì)臨床分離的攜帶不同毒力基因的大腸桿菌O157∶H7生物被膜的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了72 h的連續(xù)觀察，生物培養(yǎng)膜片和玻璃試管上的生物被膜生長(zhǎng)周期是一致的。

結(jié)果顯示攜帶不同毒力基因的大腸桿菌O157∶H7生物被膜形成時(shí)間有差異，標(biāo)準(zhǔn)株和L2形成生物被膜較早，L1較晚，即標(biāo)準(zhǔn)株和L2完整的生物被膜是在36 h時(shí)形成的，L1菌株完整生物被膜是在48 h。此現(xiàn)象可能為其來(lái)自不同的宿主，所攜帶的毒力因子不同，毒力因子在大腸桿菌O157∶H7的免疫致病過(guò)程中起著重要作用，不同宿主來(lái)源的大腸桿菌O157∶H7其攜帶的毒力因子也不完全相同，因此，不同來(lái)源的大腸桿菌O157∶H7菌株其生物學(xué)特性、粘附特性等均有一定差別。

3.4毒力基因的檢測(cè) 由于大腸桿菌O157∶H7的致病力取決于其攜帶的毒力基因，所以對(duì)大腸桿菌O157∶H7毒力基因的檢測(cè)非常必要。大腸桿菌O157∶H7的毒力基因主要有：產(chǎn)生細(xì)胞溶血素的hylA基因，產(chǎn)生志賀菌素的stx1和stx2基因，產(chǎn)生大腸桿菌黏附毒素的eaeA基因等。據(jù)報(bào)道人類感染大腸桿菌后發(fā)病多與stxl、stx2和eaeA等有關(guān)[13, 15]，因此本試驗(yàn)從牛源樣品中分離大腸桿菌O157∶H7，并根據(jù)GenBank中編碼大腸桿菌O157的O抗原的rfbE基因、H抗原的fliC基因、細(xì)胞溶血素的hlyA基因、志賀菌素的stx2基因以及大腸桿菌黏附素的eaeA基因?yàn)榘谢虻?種基因的特異性序列，設(shè)計(jì)并合成5對(duì)引物，運(yùn)用多重PCR方法快速的檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7臨床分離株所攜帶的毒力基因，結(jié)果表明2株大腸桿菌O157∶H7均帶有hlyA、eaeA基因，一株還帶有Stx2毒力基因，為進(jìn)一步研究大腸桿菌O157∶H7的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。關(guān)于各毒力基因之間的關(guān)系，以及各毒力基因在大腸桿菌O157∶H7致病過(guò)程中的作用機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。

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