RNA恒溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合熔解曲線分析鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的應(yīng)用研究

李園園，程 松，陸俊梅，胡忠義，崔振玲

胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)是鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumavium-intracellularecomplex，MAC)中一類重要的病原菌亞種，可以導(dǎo)致人肺部、淋巴結(jié)、皮膚等多器官的感染，也可導(dǎo)致動(dòng)物的感染和傳播[1-3]，是一類重要的人獸共患病傳染源。胞內(nèi)分枝桿菌與MAC內(nèi)其他亞種感染的宿主存在差異[2-3]，對(duì)治療藥物的藥物敏感性也存在差異[4]，因此對(duì)胞內(nèi)分枝桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定對(duì)于MAC病的流行病學(xué)研究和臨床治療具有重要意義。本研究建立了RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)聯(lián)合熔解曲線分析技術(shù)(RNA isothermal transcription-mediated amplification and real-time detection combined melt curve analysis，RIARD-MCA)快速鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的方法，并初步評(píng)價(jià)其對(duì)臨床分離株的鑒定效果。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.121種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，來(lái)自國(guó)家菌種保存中心，分別為：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(M.tuberculosis，ATCC27294)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansassi，ATCC12478)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare，ATCC13950)、龜分枝桿菌(M.chelonae，ATCC14472)、草分枝桿菌(M.phlei，ATCC11758)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum，ATCC6481)、戈登分枝桿菌(M.gordonae，ATCC14470)、金色分枝桿菌(M.aurum，ATCC23366)、淡黃分枝桿菌(M.gilvum，ATCC43909)、副偶發(fā)分枝桿菌(M.parafortuitum，ATCC19686)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis， ATCC19420)、海分枝桿菌(M.marinum，ATCC927)、愛知分枝桿菌(M.aichiense，ATCC27280)、新金色分枝桿菌(M.neoaurum， ATCC25795)、土分枝桿菌(M.terra，ATCC19619)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum，ATCC19530)、母牛分枝桿菌(M.vaccae，ATCC15483)、田鼠分枝桿菌(M.microti，ATCC19422)、鳥分枝桿菌(M.avium，ATCC25291)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum，ATCC19981)、瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense，ATCC29571)。

1.1.25種呼吸道常見非分枝桿菌致病菌，由上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科普通微生物實(shí)驗(yàn)室分離并經(jīng)過(guò)16S rRNA測(cè)序鑒定[5]，分別為：肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、溶血性鏈球菌(Hemolyticstreptococcus)、綠膿假單胞菌(Pseudomonaspyocyaneum)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)。

1.1.3180株NTM臨床分離株和49株MTB臨床分離株，來(lái)自上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病(肺)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌株庫(kù)。

1.2方法

1.2.1RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌方法 以胞內(nèi)分枝桿菌的16S rRNA的特異序列為檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)RNA探針和帶有T7啟動(dòng)子的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增引物，建立胞內(nèi)分枝桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增體系。將待檢菌株13 000 r/min離心5 min，棄上清，加入50 μL樣本稀釋液(10 mmol/L檸檬酸鈉，pH8.0，DEPC處理過(guò)的無(wú)菌H2O配制)重懸后放入超聲清洗器中進(jìn)行超聲處理15 min，超聲功率300 W。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照與待檢菌株同步進(jìn)行，陽(yáng)性對(duì)照為活的胞內(nèi)分枝桿菌，陰性對(duì)照為無(wú)菌水。超聲結(jié)束后，取2 μL處理物加入預(yù)先混合好的30 μL擴(kuò)增檢測(cè)液(40 mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH 8.1, 8 mmol/L 氯化鎂, 25 mmol/L 氯化鈉, 2 mmol/L 亞精胺, 5 mmol/L 二硫蘇糖醇, 80 μg/mL 牛血清白蛋白，dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各200 μmmol/L, ATP、GTP、CTP和 UTP各1 mmol/L，引物濃度和探針濃度均為0.5 mmol/L)中。將反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min后，再置于42 ℃保溫5 min，同時(shí)將酶液預(yù)熱至42 ℃。預(yù)熱后，向每支反應(yīng)管中加入10 μL酶液(含M-MLV和T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶各2000 U)，混勻后將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500，購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司)中啟動(dòng)反應(yīng)程序。反應(yīng)程序?yàn)椋簾晒馔ǖ涝O(shè)定為FAM，每個(gè)循環(huán)為42 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)收集每分鐘進(jìn)行1次，共檢測(cè)40次。樣本曲線與閾值線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)為dt值，dt<40的樣本為擴(kuò)增陽(yáng)性樣本。RNA恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行40 ℃～95℃熔解曲線分析。RNA恒溫?cái)U(kuò)增曲線陽(yáng)性且熔解曲線與胞內(nèi)分枝桿菌陽(yáng)性對(duì)照一致的判定為胞內(nèi)分枝桿菌；僅擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，但熔解曲線與胞內(nèi)分枝桿菌不一致，或者擴(kuò)增曲線陰性則判定為非胞內(nèi)分枝桿菌。引物序列5′-TTCTAAGCCTGGGAAA-3′和5′-AATTTAATACGACTCACGGGATATAGGGAGACCACCAACAAGCTGATAGGC-3′，探針序列為5′-CGUGGACCUUUAGGCGCACCACG-3′，5′端FAM標(biāo)記，3′端DABCYL標(biāo)記。檢測(cè)全程操作及檢測(cè)時(shí)間約2 h。引物由上海生物工程公司合成，RNA探針由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，其他檢測(cè)試劑購(gòu)自上海仁度生物科技有限公司。

1.2.2RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌特異度 將21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株在米氏7H10培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Becton，Dickinson)上的陽(yáng)性培養(yǎng)物和5種呼吸道常見致病非分枝桿菌在血平板培養(yǎng)基(溶血性鏈球菌)和麥康凱培養(yǎng)基(銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、綠膿假單胞菌)上的陽(yáng)性培養(yǎng)物，用生理鹽水磨菌比濁至1 mg/mL，各取1 mL菌懸液進(jìn)行RIARD-MCA檢測(cè)。

1.2.3RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌靈敏度 將胞內(nèi)分枝桿菌在米氏7H10上培養(yǎng)的陽(yáng)性培養(yǎng)物，用生理鹽水磨菌比濁至1 mg/mL(相當(dāng)于1×107條細(xì)菌/mL)，再用生理鹽水作1×10-1～1×10-9稀釋。從每個(gè)稀釋度取1 mL菌懸液進(jìn)行RIARD-MCA檢測(cè)，同時(shí)每個(gè)稀釋度取100 μL菌懸液接種于米氏7H10培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3周后進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

1.2.4RIARD-MCA鑒定分枝桿菌臨床分離株 將229株分枝桿菌臨床分離株的陽(yáng)性培養(yǎng)物，每份陽(yáng)性培養(yǎng)物等分為3份，一份用于RIARD-MCA檢測(cè)，一份用于測(cè)序檢測(cè)，一份凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR基因測(cè)序菌種鑒定 用測(cè)序法對(duì)所有菌株的16S rRNA及hsp65基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，16S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物序列為：F1：5’- TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’，R1：5’- TACCGCGGCTGCTGGCAC-3’，片段大小為500 bp[5]。hsp65基因擴(kuò)增引物為：F2:5’-ATCGCCAAGGAGATCGAGCT-3’，R2:5’-AAGGTGCCGCGGATCTTGTT-3’，片段大小為644 bp[6]。PCR擴(kuò)增試劑使用PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶及配套緩沖液(購(gòu)自大連寶生物公司)，測(cè)序送華大基因測(cè)序部完成。測(cè)序結(jié)果通過(guò)http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站的核酸blast在線比對(duì)軟件進(jìn)行同源性分析，以鑒定菌種。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以PCR基因測(cè)序菌種鑒定結(jié)果為參考方法，評(píng)價(jià)RIARD-MCA法鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和kappa檢驗(yàn)值。

2 結(jié) 果

2.1RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌特異度 21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和5種呼吸道常見致病非分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果顯示：RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)胞內(nèi)、鳥分枝桿菌均為陽(yáng)性(圖1a)，熔解曲線可有效區(qū)分胞內(nèi)與鳥分枝桿菌(圖1b)，RNA恒溫?cái)U(kuò)增陽(yáng)性且熔解曲線起峰位置與胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株一致為胞內(nèi)分枝桿菌。

2.2RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌靈敏度 RIARD-MCA可以檢測(cè)至10-5mg/mL檢測(cè)管，根據(jù)米氏7H10培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，10-5mg/mL檢測(cè)管對(duì)應(yīng)100 CFU/mL濃度，RIARD-MCA靈敏度可達(dá)100 CFU/mL(圖2)。

圖1RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌檢測(cè)圖中英文對(duì)照

Fig.1SpecificityofRIARD-MCAonidentificationanddetectionforM.intracellulare

a: Amplification curve of RIARD-MAC; b: Melting curve of RIARD-MCA;

1, 5:M.intracellulare; 2, 4:M.avium; 3, 6: Othermycobacterium, 5 common bacteria of respiratory tract and negative control.

圖2RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌靈敏度檢測(cè)圖

Fig.2SensitivityofRIARD-MCAonidentificationanddetectionforM.intracellulare

1: 107CFU/mL; 2: 106CFU/mL; 3: 105CFU/mL; 4: 104CFU/mL; 5: 103CFU/mL; 6: 102CFU/mL; 7: 101CFU/mL, 100CFU/mL, 10-1, 10-2, 10-3CFU/mL and negative control.

2.3RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株結(jié)果 229株分枝桿菌臨床分離株中，RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌63株；PCR測(cè)序63株全為胞內(nèi)分枝桿菌。

166株RIARD-MCA判定為非胞內(nèi)分枝桿菌，PCR測(cè)序全為非胞內(nèi)分枝桿菌。其中鳥分枝桿菌7株，偶發(fā)分枝桿菌5株，堪薩斯分枝桿菌3株，膿腫分枝桿菌36株，龜分枝桿菌1株，M.massiliense21株，M.bolletii2株，海分枝桿菌5株，戈登分枝桿菌7株，金色分枝桿菌13株，瘰疬分枝桿菌1株，副瘰疬分枝桿菌2株，MTB 49株，M.colombiense2株，M.marseillense3株，其余9株blast沒(méi)找到完全匹配的菌種，分別接近慢性黃分枝桿菌(M.lentiflavum)，戈登分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、土分枝桿菌、M.algericum、M.engbekii、M.kumamotonense、M.peregrinum、M.interjectum。以PCR測(cè)序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，RIARD-MCA法鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為100%、100%，100%、100%，kappa值為1(表1)。

表1229株分枝桿菌RIARD-MCA鑒定結(jié)果

Tab.1RIARD-MCAidentificationanddetectionof229mycobacteria

RIARD-MCA基因測(cè)序Gene sequencing胞內(nèi)分枝桿菌M. intracellular其他分枝桿菌Other mycobacteria胞內(nèi)分枝桿菌M. intracellular630其他分枝桿菌Other mycobacteria0166

3 討 論

近年來(lái)，非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculousmycobacteria，NTM)病在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[7]。胞內(nèi)分枝桿菌時(shí)一種可導(dǎo)致人類感染發(fā)病的病原體，其感染率在MAC感染中可達(dá)45%～81%[7-9]。胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌是MAC中兩個(gè)重要的亞種，均可侵犯人和動(dòng)物的肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、皮膚、胃腸道及泌尿生殖道等并造成全身散播[1-4]，但其致病宿主、發(fā)病過(guò)程及治療均存在一定差異。MAC亞種的準(zhǔn)確區(qū)分鑒定，對(duì)于明確傳染源，了解病原體的傳播，制定更加準(zhǔn)確有針對(duì)性的治療方案具有重要的意義，因此，有效區(qū)分鳥、胞內(nèi)分枝桿菌至關(guān)重要。胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌均屬于緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，通過(guò)傳統(tǒng)的生化方法很難區(qū)分，在無(wú)菌種鑒定的情況下易被誤診為結(jié)核分枝桿菌感染[10]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和對(duì)菌種基因序列研究的深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均通過(guò)引入新的分子鑒定方法使分枝桿菌菌種鑒定從表型和生化水平轉(zhuǎn)入基因水平，并開始應(yīng)用于分枝桿菌感染的分子診斷[4，11-13]。

Richardson等[11]以16S rRNA為檢測(cè)靶標(biāo)采用多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，檢測(cè)MAC的靈敏度為99%，但尚無(wú)法區(qū)分鳥、胞內(nèi)分枝桿菌。Park等[12]以ITS為檢測(cè)靶標(biāo)采用DNA探針雜交只能鑒定到MAC，也無(wú)法區(qū)分鳥、胞分枝桿菌。Kim等[13]以hsp65為鑒定靶標(biāo)采用多探針熒光定量PCR聯(lián)合熔解曲線分析可以準(zhǔn)確鑒定胞內(nèi)分枝桿菌。上述基于DNA靶標(biāo)的檢測(cè)，多數(shù)菌種鑒定僅限于MAC水平，且以DNA為靶標(biāo)的檢測(cè)無(wú)法區(qū)分死菌活菌，還易受到DNA氣溶膠的污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。法國(guó)生物梅里埃公司的Accuprobe胞內(nèi)分枝桿菌檢測(cè)試劑盒[4]，以胞內(nèi)分枝桿菌核糖體RNA為檢測(cè)靶標(biāo)，通過(guò)RNA探針與臨床分離株菌體釋放出的RNA直接雜交檢測(cè)胞內(nèi)分枝桿菌，從而實(shí)現(xiàn)較高的特異度，但該試劑盒需要較大的菌量。

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功建立基于RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法[14]，根據(jù)研究報(bào)道16S rRNA序列可以區(qū)分鑒定鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌[15]，本研究以胞內(nèi)分枝桿菌的16S rRNA的特異序列為檢測(cè)靶標(biāo)，利用帶有T7啟動(dòng)子的引物，在恒溫條件下大量擴(kuò)增靶標(biāo)RNA，通過(guò)胞內(nèi)分枝桿菌特異的RNA探針與靶標(biāo)RNA的特異雜交，釋放出熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胞內(nèi)分枝桿菌的檢測(cè)。與其他以16S rDNA為靶標(biāo)的研究相似，由于胞內(nèi)分枝桿菌與鳥胞復(fù)合群內(nèi)其他亞種的16S rRNA靶標(biāo)序列僅有1～3個(gè)堿基的差異，僅通過(guò)RNA探針雜交難以準(zhǔn)確區(qū)分胞內(nèi)分枝桿菌與其他鳥胞內(nèi)分枝桿菌亞種[11]，本研究為了進(jìn)一步提高胞內(nèi)分枝桿菌檢測(cè)的特異度，將RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)與熔解曲線分析聯(lián)合使用，可大幅提高檢測(cè)胞內(nèi)分枝桿菌的特異度。

本研究以16s rDNA和hsp65基因測(cè)序?yàn)榉肿泳N鑒定為參考方法[5-6]，對(duì)RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌具有較高的特異度，與結(jié)核分枝桿菌、18種非結(jié)核分枝桿菌及呼吸道常見的非分枝桿菌無(wú)交叉反應(yīng)，且能在229株23種分枝桿菌臨床分離株中準(zhǔn)確的鑒定胞內(nèi)分枝桿菌，其特異度可達(dá)100%，與Kim等[13]以hsp65 DNA為靶標(biāo)的檢測(cè)研究結(jié)果相同。RIARD-MCA擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA，極易降解，相比較DNA擴(kuò)增可減少實(shí)驗(yàn)室的交叉污染，且16S rRNA在活菌內(nèi)的拷貝數(shù)高于hsp65 DNA的拷貝數(shù)，可以提高檢測(cè)的靈敏度。RIARD-MCA法檢測(cè)胞內(nèi)分枝桿菌與Accuprobe胞內(nèi)分枝桿菌檢測(cè)試劑盒的特異度相似，檢測(cè)臨床分離株的靈敏度也均為100%[4]，但是RIARD-MCA檢測(cè)胞內(nèi)分枝桿菌臨床分枝株方法學(xué)靈敏度為100 CFU/mL，其方法學(xué)檢測(cè)靈敏度高于Accuprobe胞內(nèi)分枝桿菌檢測(cè)試劑盒，具有直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中胞內(nèi)分枝桿菌的潛力。

本研究建立的RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌方法，RNA提取僅需要15 min超聲裂解，不需要復(fù)雜的提取過(guò)程，操作簡(jiǎn)單，用一般實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配備的實(shí)時(shí)定量PCR儀即可進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間僅約2 h，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，可以作為一種新型胞內(nèi)分枝桿菌分子鑒定方法用于臨床分離株的鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[1]Karakousis PC, Moore RD, Chaisson RE.Mycobacteriumaviumcomplex in patients with HIV infection in the era of highly active antiretroviral therapy[J]. Lancet Infect Dis, 2004, 4(9): 557-565.

[2]Aravindhan V, Sulochana S, Narayanan S, et al. Identification & differentiation ofMycobacteriumaviumandM.intracellulareby PCR-RFLP assay using the groES gene[J]. Indian J Med Res, 2007, 126(6): 575-579.

[3]Shin SJ, Anklam K, Manning EJ, et al. Rapid mycobacterial liquid culture-screening method forMycobacteriumaviumcomplex based on secreted antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Clin Vaccine Immunol, 2009, 16(5): 613-620. DOI:10.1128/CVI. 00461-08

[4]Saito H, Tomioka H, Sato K, et al. Identification and partial characterization ofMycobacteriumaviumandMycobacteriumintracellulareby using DNA probes[J]. J Clin Microbiol, 1989, 27(5): 994-997.

[5]Hall L, Doerr KA, Wohlfiel SL, et al. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4): 1447-1453.

[6]McNabb A, Eisler D, Adie K, et al. Assessment of partial sequencing of the 65-kilodalton heat shock protein gene (hsp65) for routine identification ofMycobacteriumspecies isolated from clinical source[J]. J Clin Micmbiol, 2004, 42(7): 3000-3011.

[7]Thomson RM, NTM working group at Queensland TB Control Centre and Queensland Mycobacterial Reference Laboratory. Changing epidemiology of pulmonarynontuberculousmycobacteriainfections[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(10): 1576-1583. DOI:10. 3201/eid1610. 091201

[8]Simons S, van Ingen J, Hsueh PR, et al. Nontuberculous mycobacteria in respiratory tract infections, eastern Asia[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(3): 343-349. DOI:10. 3201/eid1703. 100604

[9]Koh WJ, Jeong BH, Jeon K, et al. Clinical significance of the differentiation betweenMycobacteriumaviumandMycobacteriumintracellulareinMaviumcomplex lung disease[J]. Chest, 2012, 142(6): 1482-1488. DOI:10. 1378/chest. 12-0494

[10]Chinese Anti-tuberculosis Association Professional Committee Compile. Laboratory test procedures of Tuberculosis diagnostic [M]. Beijing: Chinese Education Culture Press, 2006: 1. (in Chinese)

中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì). 結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京:中國(guó)教育文化出版社,2006：1.

[11]Richardson ET, Samson D, Banaei N. Rapid identification ofMycobacteriumtuberculosisandNontuberculousmycobacteriaby multiplex, real-time PCR[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(5): 1497-1502. DOI:10. 1128/JCM. 01868-08

[12]Park H, Jang H, Song E, et al. Detection and genotyping ofMycobacteriumspecies from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(4): 1782-1788.

[13]Kim K, Lee H, Lee MK, et al. Development and application of multiprobe real-time PCR method targeting thehsp65 gene for differentiation ofMycobacteriumspecies from isolates and sputum specimens[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(9): 3073-3080. DOI:10. 1128/JCM. 00939-10

[14]Cui Z, Wang Y, Fang L, et al. Novel real-time simultaneous amplification and testing method to accurately and rapidly detectMycobacteriumtuberculosiscomplex[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(3): 646-650. DOI:10. 1128/JCM. 05853-11

[15]Foongladda S, Phplwat S, Eampokalap B, et al. Multi-probe real-time PCR identification of commonMycobacteriumspecies in blood culture broth[J]. J Mol Diagn, 2009, 11(1): 42-48. DOI:10. 2353/jmoldx. 2009. 080081