云南省2005-2012年91株甲型副傷寒沙門菌病原學特征分析

陳玉娟,尹建雯,古文鵬,李超群,楊建斌,徐 聞,伏曉慶

云南省是傷寒副傷寒的高發(fā)地區(qū)之一，近年來發(fā)病率及發(fā)病數(shù)均居全國首位。而玉溪市、紅河州和德宏州,尤其玉溪市是云南省傷寒副傷寒的高發(fā)地區(qū)。近年來，云南省的發(fā)病情況以副傷寒為主，特別是甲型副傷寒逐漸成為了優(yōu)勢菌株。其中又以玉溪市的甲型副傷寒發(fā)病最為嚴重。我們通過對云南省2005-2012年8年間監(jiān)測的91株甲型副傷寒沙門菌進行病原學特征分析，從菌株的耐藥性和分子分型角度揭示云南省甲型副傷寒的流行規(guī)律和特點，為制定有針對性的防治措施提出依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 91株甲型副傷寒沙門菌均為2005-2012年間分離得到的菌株，其中玉溪市72株，紅河州14株，見表1。

表1 云南省2005-2012年 91株甲型副傷寒沙門菌菌株分布情況

1.2主要儀器 脈沖場凝膠電泳儀(Bio-Rad CHEF Mapper)，凝膠成像儀(Bio-Rad GEL Doc2000)。

1.3試劑XbaI和SpeI限制性內切酶購自日本TaKaRa公司；SeaKem Gold Agarose購自美國 Cambraex Bio Rockland公司；藥敏紙片均購于英國OXOID公司，按規(guī)定貯存并在有效期內使用；M-H瓊脂，購于北京陸橋生物科技公司。

1.4方法

1.4.1藥敏試驗 采用K-B紙片法進行，藥敏試驗結果判斷根據(jù)按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)微生物敏感試驗[1]執(zhí)行，試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。根據(jù)《全國傷寒副傷寒監(jiān)測方案》中提及的抗生素藥物進行藥敏試驗，主要選取10種抗生素，分別是：氨芐西林(AMP)、阿莫西林/棒酸(AMC)、頭孢噻吩(CFT)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TBT)、利福平(RFA)和復方新諾明(SMZ)。

1.4.2脈沖場凝膠電泳(PFGE) 具體操作過程見參考文獻[2]，并按PulseNet公布的沙門菌PFGE標準過程進行操作和參數(shù)設置(Auto Algorithm：30 kb-low MW，700 kb-high MW，電泳時間為19 h)，每塊膠酶的用量為XbaI 45 U，SpeI 30 U(具有相同的XbaI酶切帶型的菌株再用SpeI進行酶切)，37 ℃分別酶切2 h。電泳結束后用Gelred核酸染料染色30 min，純水脫色30 min，凝膠成像儀上讀取圖像。

1.4.3聚類分析 聚類分析采用BioNumerics V5.10軟件進行聚類分析，應用非加權組平均法(UPGMA)，聚類相似性系數(shù)采用基于條帶比較的Dice。Dice=2×N/(N+M)，N表示能匹配的條帶個數(shù)，M表示所有的條帶個數(shù)(2株菌帶型上的條帶數(shù)總和再減去匹配的條帶數(shù))。

2 結 果

2.1藥敏試驗結果 2005-2012年間監(jiān)測的91株甲型副傷寒沙門菌株均對萘啶酸和利福平耐藥，而對阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；多重耐藥菌株則較少出現(xiàn)。各年間菌株的敏感性之間存在差異(χ2=58.414,P<0.01),表明近年來甲型副傷寒菌株對藥物的敏感性有所增加，見表2。

各地區(qū)菌株耐藥情況不盡相同，表現(xiàn)為玉溪市72株甲型副傷寒沙門菌株對萘啶酸和利福平耐藥，對阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；而紅河州的14株甲型副傷寒沙門菌株對萘啶酸、四環(huán)素、利福平耐藥；而對阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；德宏州的3株甲型副傷寒沙門菌對氨芐西林、萘啶酸、四環(huán)素、利福平藥，表現(xiàn)為多重耐藥；昆明市和曲靖市的各一株菌株也表現(xiàn)為多重耐藥，見表3。

2.2PFGE結果 91株甲型副傷寒沙門菌的XbaI酶切帶型主要分為兩個大的聚類群，如圖1所示。從圖中可以看出，云南省的玉溪市為甲型副傷寒的高發(fā)地區(qū)之一，并且不同年份的分離菌株具有相同的XbaI酶切帶型。除玉溪外，云南省的紅河、德宏等地區(qū)的分離菌株與玉溪的菌株也具有相同的XbaI酶切帶型。其中，2006-5是一株分離自曲靖市陸良縣的暴發(fā)疫情菌株，其帶型與監(jiān)測菌株具有較高的同源性關系，二者的相似度為96.5%。而2005-1是從健康體檢中分離出的一株甲型副傷寒沙門菌，其帶型與玉溪、紅河等地區(qū)的監(jiān)測菌株一致。

表2 云南省2005-2012年91株甲型副傷寒沙門菌各年藥敏結果

Note: * means Resistant; # means Intermediate; & means Susceptible.

表3 云南省2005-2012年各地區(qū)甲型副傷寒沙門菌株耐藥情況

Note: * means Resistant; # means Intermediate; & means Susceptible.

我們選取部分具有相同XbaI酶切帶型的代表性菌株用SpeI再次進行PFGE電泳，以確認菌株之間的同源性關系，如圖2所示。結果表明，雙酶切后菌株的分布關系與XbaI單個酶切的關系相一致，同樣分為了兩個聚類群，不同地區(qū)、年份的分離菌株雙酶切帶型具有一致性。

3 討 論

傷寒副傷寒是國家乙類法定傳染病。近年來，隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展，全國以及云南省的傷寒副傷寒發(fā)病率呈逐年下降趨勢，但云南省的發(fā)病情況與全國相比位居首位，已成為云南省重要的公共衛(wèi)生問題。2011年全國7個省13個傷寒副傷寒監(jiān)測點中，云南省占2個。2011年《中國重點傳染病和病媒生物監(jiān)測報告》顯示，云南省勐?？h、云南省紅塔區(qū)的發(fā)病率最高(分別為48.67/10萬和49.42/10萬)。

以往由傷寒沙門菌引起的傷寒發(fā)病率較高，但近些年來，甲型副傷寒在全球的一些國家，如中國[3]、印度[4]、尼泊爾[5]、巴基斯坦[6]、臺灣[7]等地發(fā)病率逐年上升[8]，尤其是中國的一些地區(qū)[9]，副傷寒的發(fā)病率已經(jīng)超過了傷寒的發(fā)病率。

北美、歐洲尤其是東南亞地區(qū)近年甲型副傷寒暴發(fā)流行，故甲型副傷寒被列為近年重要的再發(fā)傳染病[10-14]。副傷寒的發(fā)病主要在東南亞地區(qū)，發(fā)病數(shù)約占到了所有傷寒病例的50%[15-17]，印度、新加坡從1996年，日本2000年出現(xiàn)了甲型副傷寒暴發(fā)[18-19]。中國從1998、1999年先后，在貴州、浙江、廣西、廣東等省都出現(xiàn)多起甲型副傷寒的暴發(fā)，在部分傷寒的傳統(tǒng)疫區(qū)甚至取代傷寒而成為優(yōu)勢菌型[20]。

圖12005-2012年云南省91株甲型副傷寒沙門菌PFGE-XbaI酶切結果

Fig.1DistributiononPFGEpatternsof91SalmonellaparatyphiAstrainsisolatedinYunnanProvincedigestedbyXbaI,2005-2012

圖2XbaI和SpeI雙酶切帶型相同的菌株PFGE結果

Fig.2DoubleenzymedigestionofXbaIandSpeIonthesamestrainpatternsofPFGE

近年來云南省成為全國甲型副傷寒沙門菌流行的高發(fā)地區(qū)，而玉溪市又是云南省副傷寒主要流行的地區(qū)。1999年以來，玉溪市是中國最嚴重的甲型副傷寒疫病區(qū)[21]。

對91株甲型副傷寒沙門菌的藥敏試驗結果分析發(fā)現(xiàn)，云南省的甲型副傷寒沙門菌對萘啶酸和利福平耐藥，而對阿莫西林/棒酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感；僅有較少數(shù)量的菌株出現(xiàn)多重耐藥情況。張瑩[22]等對2006-2008年云南省傷寒、副傷寒監(jiān)測點(紅塔區(qū)和澄江縣)分離的部分甲型副傷寒菌株進行藥敏試驗，結果顯示甲型副傷寒對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素等大多數(shù)抗生素普遍敏感，對利福平、萘啶酸耐藥，與本研究的結果一致。

脈沖場凝膠電泳分型技術具有對細菌整個染色體進行分析，重復性好，區(qū)分能力強，結果穩(wěn)定且更易解釋，被推薦為多種致病菌分型的金標準[23]。而用XbaI 酶切的甲型副傷寒PFGE 分辨率最高，具有最大區(qū)分能力的電泳參數(shù),XbaI PFGE在顯示多個克隆變異方面有較高的分辨力[24-25]，而SpeI PFGE 是把真正克隆區(qū)分開來的一種堅實手段并能用于檢測克隆內的微進化[26]。

從91株甲型副傷寒沙門菌的PFGE結果可以看出云南省的副傷寒形成了兩個高度分化的克隆群菌株。李偉[2]等的研究發(fā)現(xiàn)，甲型副傷寒大部分屬于高度相似的克隆系，在不同省份、不同年代廣泛存在。張雯霞[27]等的研究也發(fā)現(xiàn)甲型副傷寒間有較高的同源性。伏曉慶[28]等對國家傷寒副傷寒防治示范基地項目獲得的玉溪市212株甲型副傷寒用XbaI進行酶切，發(fā)現(xiàn)其變異不大，有可能是同一克隆系的甲型副傷寒沙門菌。本研究結果進一步證實了甲型副傷寒沙門菌變異性不大等特點。

2008-2010年，中國疾病預防控制中心在云南省玉溪市開展傷寒副傷寒防治示范基地項目，通過建立基于全人群的發(fā)熱癥狀監(jiān)測系統(tǒng)，開展傷寒副傷寒病例對照調查和實施綜合干預措施，使該地區(qū)發(fā)病水平得到一定控制。但從本研究的結果仍然可以看出，云南省玉溪市仍然存在甲型副傷寒的流行。而且從PFGE的結果可以推斷云南省不同地區(qū)的甲型副傷寒流行可能具有相似的傳播途徑的特點，可能是由某個區(qū)域的菌株不斷擴散傳播出去，形成了兩個高度分化的克隆群菌株[29]，從各地監(jiān)測菌株的分子分型結果可以看出這一點?；谶@些研究結果，我們認為目前云南省傷寒副傷寒菌株的傳播途徑和機制仍然還未得到有效控制，還需針對傷寒副傷寒高發(fā)地區(qū)進行高危因素防控工作。

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