結(jié)核分枝桿菌rHpsX-MPT64融合蛋白的制備與臨床應用

張 艷，范大鵬，岳永寧，杜 蓬， 孫愛華

結(jié)核病已成為當前嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題[1]。簡便、快速而準確的實驗室診斷對病人及時、有效的治療至關(guān)重要[2]。細菌學檢查目前仍是結(jié)核病診斷的金標準，但涂片陽性率低、培養(yǎng)所需時間太長，不能滿足臨床快速診治需要，因此迫切需要開展快速、高靈敏度的的檢測技術(shù)[2]。檢測結(jié)核病患者血清抗體的血清學方法具有快速、簡便已成為結(jié)核病最重要的診斷方法，國內(nèi)外已有較多報道[2-3]。我們通過連接引物PCR構(gòu)建融合基因hpsX-mpt64并克隆和原核表達，然而以重組蛋白rHspx、rMPT64和rHspx-MPT64為包被抗原的酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測277例肺結(jié)核患者的血清標本，探討其在肺結(jié)核病實驗診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株及主要試劑 H37Rv、原核表達載體pET42a、宿主菌E.coliDH5α及E.coliBL21DE3均來自浙江大學病原生物系；DNA提取試劑盒購自BioColor公司，PCR試劑、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA膠回收試劑盒、T-A克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、IPTG、DNA及蛋白分子量參考標準品、Ni-NTA親和層析材料等均由TaKaRa公司提供。HRP-羊抗人IgG和HRP-羊抗鼠IgG購自Immuno Research公司?？笻is抗體購自Novagen公司。

1.1.2血清來源 277例結(jié)核病患者血清來自于根據(jù)臨床表現(xiàn)、痰涂片和培養(yǎng)及X-線輔助診斷為肺結(jié)核的浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(浙江省結(jié)核病診斷治療中心)住院結(jié)核病患者，其中痰涂片陽性192例、陰性85例，73例非肺結(jié)核患者血清來自本院呼吸科住院肺炎、肺氣腫等肺部疾病患者，150例健康對照血清標本來自于無結(jié)核病史、痰培養(yǎng)陰性且X-線輔助診斷無異常本院健康體檢者。

1.2方法

1.2.1hpsX和mpt64基因的擴增 采用基因組DNA快速制備試劑盒(BioColor)提取標準菌株H37Rv的DNA。根據(jù)GenBank中登錄H37Rv標準菌株hspX和mpt64基因序列[4](NC_000962)及其內(nèi)切酶圖譜分析結(jié)果，設(shè)計用于hspX和mpt64基因擴增的引物。hspX基因引物序列：上游 5’-CGCGGA TCC(BamH I) ATG GCC ACC ACC CTT CCC-3’，下游 5’-CGCAAG CTT(Hind III) TCA GTT GGT GGA CCG GAT CTG-3’； mpt64基因引物序列：上游 5’-CGCCAT ATG(Nde I) CGC ATC AAG ATC TTC ATG-3’，下游 5’-CGCGGA TCC(BamH I) GGC CAG CAT CGA GTC GAT-3’。PCR總體積100 μL，內(nèi)含2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、15 mol/L MgCl2、2.5U EX-Taq酶(TaKaRa)、200 ng DNA模板、1×PCR緩沖液(pH8.3)。PCR參數(shù)：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s共30個循環(huán)，72 ℃ 7 min。采用溴乙錠預染的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。hspX和mpt64基因目的擴增片段預期大小分別為435 bp和687 bp。

1.2.2hpsX-mpt64融合基因的構(gòu)建 hpsX上游和mpt64下游引物序列同上。hpsX下游和mpt64上游連接柔性肽GGGSGGGS引物序列為。hpsX下游連接引物序列：5’-GCT GCC ACC GCC GCT GCC ACC GCC(柔性肽GGGSGGGS序列) GTT GGT GGA CCG GAT CTG -3’。mpt64上游連接引物序列：5’-GGC GGT GGC AGC GGC GGT GGC AGC(柔性肽GGGSGGGS序列) Atg CGC ATC AAG ATC TTC ATG -3’。按上法將hpsX和mpt64基因擴增后，用小量DNA 3S柱快速離心純化試劑盒(BioColor)回收目的片段，分光光度法測定其DNA濃度[5]。將上述回收的hpsX和mpt64基因目的擴增片段后等摩爾混合(DNA總量<500 ng)，反應參數(shù)：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 180 s共10個循環(huán)，72 ℃ 15 min，除不加引物外，其余反應成分及含量與上述PCR相同，如此可利用hpsX下游和mpt64上游連接引物中互補的柔性肽序列形成hpsX-mpt64復合模板。然后加入hpsX上游和mpt64下游引物各250 nmol/L，PCR參數(shù)：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 120 s共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，hpsX-mpt64融合基因擴增片段預期大小為1 146 bp。

1.2.3目的基因T-A克隆、亞克隆和測序 采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)，分別將上述hpsX、mpt64基因及hpsX-mpt64融合基因擴增片段克隆至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α并用LB培養(yǎng)基擴增，小量堿變性法提取重組質(zhì)粒[4]，委托Invitrogen公司測序。采用對應內(nèi)切酶分別酶切重組質(zhì)粒pMD18-T- hpsX、pMD18-T- mpt64、pMD18-T- hpsX-mpt64和表達質(zhì)粒pET42a，各目的片段回收后分別連接。將構(gòu)建原核重組表達載體pET42a-hpsX、pET42a- mpt64和pET42a-hpsX-mpt64分別轉(zhuǎn)化于表達宿主菌E.coliBL21DE3中，經(jīng)培養(yǎng)擴增、提取質(zhì)粒后再次測序。

1.2.4目的重組蛋白表達和免疫反應性鑒定 構(gòu)建的原核重組表達系統(tǒng)pET42a-hpsX-E.coli BL21DE3、pET42a-mpt64-E.coli BL21DE3、pET42a-hpsX-mpt64-E.coli BL21DE3，IPTG誘導目的蛋白表達，SDS-PAGE檢查目的重組蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表達情況，用BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢測其表達產(chǎn)量，Ni-NTA親和層析法提純目的表達產(chǎn)物，純化的重組蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64進行SDS-PAGE，再將電泳凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶封閉2 h，加抗組氨酸的特異性單抗4 ℃孵育過夜，以0.2 mmol/L PBST洗滌后，加羊抗鼠IgG室溫作用1 h，以DAB顯色觀察結(jié)果。

1.2.5檢測結(jié)果的分析和比較 采用Stata 8.0統(tǒng)計學軟件中的χ2檢驗，對不同檢測方法的檢測結(jié)果進行比較，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1PCR及測序結(jié)果 采用溴乙錠預染的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。在435 bp、687 bp和1 146 bp 位置分別有hspX、mpt64和hpsX-mpt64對應目的擴增片段，見圖1。與報道的相應序列比較，所克隆的hpsX和mpt64基因核苷酸和氨基酸序列相似性均為100%。hpsX-mpt64融合基因核苷酸和氨基酸序列與hpsX和mpt64基因完全相同，各基因或融合基因的T-A克隆和亞克隆測序結(jié)果也完全相同。上述序列比較時不包括引物序列。

圖1hspX、mpt64和hpsX-mpt64基因PCR結(jié)果

Fig.1AmplificationfragmentsofhspX,mpt64andhpsX-mpt64genes

M: DNA marker (TaKaRa); 1, 3, 5: Bank control; 2, 4, 6: PCR products of hspX, mpt64 and hpsX-mpt64 genes.

2.2重組蛋白表達、提純效果及鑒定結(jié)果 IPTG能有效地誘導rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64的表達，其產(chǎn)量分別約占細菌總蛋白的20.3%、28.5%和26.5%，主要以可溶性蛋白的形式存在，提純的rHpsX-MPT64經(jīng)SDS-PAGE后均顯示為單一的蛋白條帶(圖2)。將純化后的重組蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64與抗組氨酸的特異性單克隆抗體做免疫印跡分析后顯示，分別在16.0 kDa、24.0 kDa和42.0 kDa處形成一特異條帶(此處不顯示)，表明純化的重組表達產(chǎn)物rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64有免疫反應性。

2.3ELISA檢測結(jié)果 rHpsX-ELISA、rMPT64-ELISA和rHpsX-MPT64為包被抗原的ELISA分別檢測上述150例健康人血清標本的OD450均值和SD值，OD450均值和SD值分別為0.26和0.08、0.25和0.07、0.28和0.09，故陽性判斷參考值分別為0.42、0.39和0.46。根據(jù)上述陽性判斷標準，ELISA檢測277例結(jié)核患者(包括痰涂片陽性192例、陰性85例)、73例非結(jié)核肺部疾病患者和150例健康對照人血清，結(jié)果見表1，2。rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64抗原對涂陽患者血清抗體檢出率分別為69.8%、71.9%和82.8%明顯高于涂陰患者檢出率(分別為35.3%、37.6%和55.3%)(P<0.01)。rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64抗原檢測肺結(jié)核患者血清抗體的敏感性分別為59.2%、61.4%和74.4%，rHpsX-MPT64為包被抗原建立的ELISA方法敏感性明顯高于rHpsX和rMPT64抗原(χ2=14.4和10.7，P<0.01)。

圖2rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64蛋白表達和提純效果

Fig.2ExpressionandpurificationeffectsofrHpsX,rMPT64andrHpsX-MPT64protein

M: Protein marker (Generay Biotech); 1: The pET42a-BL21 without IPTG induction; 2-4: Recombinant proteins rHpsX, rMPT64 and rHpsX-MPT64 with IPTG induction, respectively; 5-7: Purified proteins rHpsX, rMPT64 and rHpsX-MPT64, respectively.

2.4不同的ELISA方法特異性比較 rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64為包被抗原建立的ELISA檢測對照組(包括73例非肺結(jié)核患者和150例健康對照組)血清抗體，結(jié)果見表2。各ELISA檢測非肺結(jié)核患者和健康對照組方法特異性無顯著性差異(χ2=0.1～0.6，P>0.05)。rHpsX-MPT64抗原檢測對照組血清抗體特異性高于rMPT64抗原(χ2=5.2，P<0.01)，但與rHpsX抗原比無顯著性差異(χ2=0.03，P>0.05)。

表1 不同的ELISA檢測結(jié)核病患者血清結(jié)果

Note: ▲Bacterium-positive TB patients were stronger than that in the bacterium-negative (P<0.01); ◆The sensitivity of ELISA using rHpsX-MPT64 as the antigen was higher than that of ELISA using rHpsX and rMPT64 as the antigens (P<0.01).

表2 不同的ELISA方法特異性

Note: ▲P>0.05 versus healthy individuals; ◆The specificity of ELISA using rHpsX-MPT64 as the antigen was higher than that of ELISA using rMPT64 as the antigen.

3 討 論

血清學方法能快速簡便的檢測結(jié)核病患者血清抗體，為臨床診斷提供依據(jù)[2]。然而，目前已經(jīng)研究的多數(shù)結(jié)核分枝桿菌抗原血清學試驗敏感性普遍不高，特別是對涂片陰性患者檢出率更低，這就要求人們不斷努力發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核抗原建立靈敏度較高的血清診斷學方法[2-3]。由于結(jié)核患者的免疫功能、遺傳背景和治療方式不同而導致對結(jié)核桿菌抗原識別的差異性，各種抗原都有其優(yōu)缺點，目前沒有任何一種單一抗原能被全部或大多數(shù)結(jié)核病患者血清所識別[2, 6]。因此來源方便且免疫原性強的抗原仍是用于建立檢測結(jié)核病患者血清抗體方法努力的方向。HpsX蛋白主要存在于細菌的胞膜中，hpsX基因編碼蛋白分子量約為16 kD。當結(jié)核菌感染機體后，HpsX蛋白能誘導特異性的抗體免疫應答。另外，由于HpsX蛋白基因僅存在于結(jié)核分枝桿菌復合群且與結(jié)核分枝桿菌致病性相關(guān)，同時16 kD蛋白具有伴侶活性，可作為很好的協(xié)同抗原。因此，HpsX蛋白可能是一較為理想的篩選活動性肺結(jié)核的免疫學抗原[6]。MPT64是結(jié)核分支桿菌復合體分泌的一種蛋白，分子量為24 kD，可引起T細胞反應刺激淋巴細胞分泌干擾素，在結(jié)核分支桿菌分泌蛋白中是具有較高研究價值的蛋白之一[6]。

印度學者Sumi等[7]研究人工合成重組蛋白PlcA、HspX、Tb8.4和ESAT-6作為包被抗原建立ELISA用于檢測結(jié)核患者血清抗體，單個抗原包被的靈敏度范圍49.3%～60.8%，將四種抗原混合后則靈敏度提高達到75.4%；阿根廷學者Imaz1等[8]研究人工合成重組蛋白38-kDa、Ag16和Ag85B作為包被抗原建立ELISA用于檢測結(jié)核患者血清抗體，單個抗原包被的靈敏度范圍25%～42%，而混合抗原后則靈敏度提高到55%。上述研究者還證明多個抗原混合不僅提高了方法的靈敏度且能保持高度特異[7-8]，但多個抗原制備需建立多個原核表達系統(tǒng)、通過多次包被完成費時、費力。而我們在研究梅毒血清學診斷方法時建立了融合重組蛋白rTpN15-17-47為包被抗原的ELISA，臨床應用證明融合基因原核表達蛋白作為抗原進行血清學檢測不僅能提高方法的靈敏度、保持高度特異性，且避免了多個抗原獲得所需多次表達及提純抗原[9]。為此，我們用引物連接法成功構(gòu)建了hspX-mpt64融合基因，并建立了hspX-mpt64融合基因原核表達系統(tǒng)，可表達單一人工抗原分子rHpsX-MPT64，表達量達細菌總蛋白的26.5%，兩者之間以柔性短肽連接，以保持融合分子有良好的空間構(gòu)型。獲得的重組抗原rHpsX、rMPT64和融合重組抗原rHpsX-MPT64建立的ELISA用于檢測不同血清標本，rHpsX-MPT64對確診為結(jié)核病患者血清檢測的陽性率為74.4%明顯高于rHpsX(59.2%)和rMPT64抗原(61.4%)(P<0.01)，尤其是對涂片陰性結(jié)核病患者血清rHpsX-MPT64抗原檢測的陽性率也高達55.3%，明顯高于Kulshrestha A[10]等利用重組蛋白ESAT-6、CFP10、14Kda和MTC28為抗原建立ELISA檢測涂陰結(jié)核靈敏度為2%～9%、Greenaway C[11]等利用重組蛋白ESAT-6、MTB11、19-kDa和16-kDa為抗原建立ELISA檢測涂陰結(jié)核靈敏度為26%～54%的報道。且融合重組蛋白rHpsX-MPT64所建立的ELISA檢測健康對照人和非結(jié)核肺部疾病患者特異性均較高分別為90%和93.2%。本研究中建立的rHpsX-MPT64-ELISA是一種敏感性和特異性較高的結(jié)核患者血清學診斷方法。

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