雞源腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性分析

陸 彥，呂 安，趙紅玉，侯曉林，吳國(guó)娟

沙門(mén)氏菌是一種重要的人獸共患病原菌，它不僅能夠引起家禽的各種疾病，并且能夠通過(guò)污染的禽肉造成人類(lèi)沙門(mén)氏菌感染，直接威脅人體健康[1]。國(guó)內(nèi)外由于沙門(mén)氏菌造成的食物中毒和食源性疾病案例一直排名前列[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中大劑量不合理的使用抗菌藥物導(dǎo)致沙門(mén)氏菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，耐藥菌株不斷增加，耐藥譜逐年變寬，耐藥機(jī)制越來(lái)越復(fù)雜。相關(guān)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，整個(gè)沙門(mén)氏菌屬的多重耐藥率已從20世紀(jì)90年代的20%～30%增加到了本世紀(jì)初的70%[3]。張秀麗等[4]對(duì)2006-2007年河南省生肉食品中121株沙門(mén)氏菌進(jìn)行了12種抗生素的藥敏試驗(yàn)，總體上受試菌株對(duì)12種抗生素均表現(xiàn)耐藥。Biendo等[5]對(duì)51株人員鼠傷寒沙門(mén)氏菌的耐藥情況調(diào)查表明，90%以上的菌株對(duì)磺胺類(lèi)藥物、氨芐西林、鏈霉素和四環(huán)素耐藥。腸炎沙門(mén)氏菌是沙門(mén)氏菌屬致病血清型之一，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于腸炎沙門(mén)氏菌耐藥性研究較少。鑒于此，本試驗(yàn)從山東省部分地區(qū)不同場(chǎng)所采集沙門(mén)氏菌，對(duì)分離出的沙門(mén)氏菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)，了解該地區(qū)沙門(mén)氏菌耐藥情況，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基及藥品 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、MH肉湯、科瑪嘉沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。氨芐西林、四環(huán)素、磺胺異惡唑、萘啶酸等抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.2菌株 試驗(yàn)用沙門(mén)氏菌從山東省部分地區(qū)的雞孵化場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)中采集，在中國(guó)山東省農(nóng)科院畜牧所分離。雞白痢沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC533、鼠傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC541、大腸桿菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2方法

1.2.1菌株分離、鑒定和血清分型 將樣品置于無(wú)菌亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液中37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h，增殖培養(yǎng)液劃線接種于科瑪嘉沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征，紫色邊緣整齊的單個(gè)菌落判定為疑似沙門(mén)氏菌。菌株純化培養(yǎng)后通過(guò)PCR方法檢測(cè)分離株invA基因[6]，陽(yáng)性菌株確認(rèn)為沙門(mén)氏菌。

采用寧波天潤(rùn)60種沙門(mén)氏菌屬診斷血清，通過(guò)玻片凝集法對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行血清型鑒定，根據(jù)Kauffmann-White抗原表檢索沙門(mén)氏菌血清型。雞白痢沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC533和鼠傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC541為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照。

1.2.2藥物敏感性試驗(yàn) 采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)[7]推薦的微量肉湯稀釋法對(duì)分離株進(jìn)行19種臨床常用抗菌藥物的MIC值測(cè)定，測(cè)試的藥物為：氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、頭孢唑啉、達(dá)氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、萘啶酸、氟苯尼考、氯霉素、磺胺甲惡唑、磺胺異惡唑、甲氧芐啶、四環(huán)素、多西環(huán)素、多粘菌素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素。以大腸桿菌ATCC25922做藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌，結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3PCR擴(kuò)增和序列分析 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，參照GenBank中登陸的耐藥基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增Ⅰ型整合酶基因和3′-保守端基因，其引物見(jiàn)表1。另外設(shè)計(jì)合成了12對(duì)引物，分別擴(kuò)增萘啶酸、青霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)耐藥基因，PCR引物序列及大小見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括模板DNA l μL；10 nmol/L的上下游引物各1 μL；雙蒸水7 μL和2×PCR Mix10 μL。PCR 擴(kuò)增條件見(jiàn)表3。采用凝膠試劑盒回收、純化耐藥基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行序列測(cè)定，并與GenBank中的相應(yīng)耐藥基因序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.4脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 用限制性內(nèi)切酶XbaI將雞孵化場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)同時(shí)攜帶有Ⅰ型整合酶基因、3′-保守端基因、blaTEM和tetA的菌株進(jìn)行DNA染色體消化分解，根據(jù)美國(guó)Pulse Net標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)程推薦的CHER Mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行凝膠電泳。以Salmonellaserovar Braenderup H9812作為PFGE相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)菌株。電泳結(jié)果使用Bio-rad公司的Info Quest FP(Version 4.5)軟件進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)處理。

表1 沙門(mén)氏菌整合子的PCR引物序列

表2 沙門(mén)氏菌耐藥基因的PCR引物序列

表3 PCR反應(yīng)運(yùn)行參數(shù)

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌的分離鑒定 本研究從山東省部分地區(qū)雞孵化場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)3個(gè)來(lái)源992個(gè)樣品中分離出178株腸炎沙門(mén)氏菌，分離率為17.94%。陽(yáng)性腸炎沙門(mén)氏菌在孵化場(chǎng)中分離率最高為58.08%(115株)；雞養(yǎng)殖場(chǎng)中分離率為9.58%(23株)；雞屠宰場(chǎng)中分離率為7.22%(40株)，見(jiàn)表4。

表4 不同來(lái)源沙門(mén)氏菌分離率

2.2藥敏試驗(yàn) 從藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出(見(jiàn)表5)，腸炎沙門(mén)氏菌耐藥情況比較嚴(yán)重，在178株分離株中，100%的菌株對(duì)萘啶酸/磺胺甲惡唑產(chǎn)生耐藥性，為19種供試抗菌藥物中最強(qiáng)。耐磺胺異惡唑的腸炎沙門(mén)氏菌株比例為88.76%、氨芐西林為68.54%、四環(huán)素為66.85%、甲氧芐啶為64.61%、多西環(huán)素為34.27%、阿莫西林-克拉維酸為33.71%、頭孢噻呋和頭孢唑啉均為7.3%、氯霉素為5.62%、達(dá)氟沙星為3.37%、卡那霉素、諾氟沙星為2.25%、恩諾沙星和多粘菌素為1.12%。腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星比較敏感，耐藥率均為0.56%。

表5 腸炎沙門(mén)氏菌耐藥率

2.3耐藥基因檢測(cè) 125株青霉素類(lèi)耐藥的菌株中有110株檢測(cè)到blaTEM基因，檢出率達(dá)到88%，沒(méi)有擴(kuò)增出blaPSE基因。其中120株具有氨芐西林耐藥表型的菌株中112株攜帶blaTEM基因，占93.3%；124株四環(huán)素類(lèi)耐藥的菌株中有102株檢測(cè)到tetA基因，檢出率為82.25%。未檢測(cè)到tetB、tetC、tetD和tetG基因；178株腸炎沙門(mén)氏菌株中有86株檢測(cè)到IntⅠ，檢出率為48.3%。所有IntⅠ基因陽(yáng)性菌株均擴(kuò)增到了3′-保守端基因；萘啶酸耐藥菌株中檢測(cè)到5株攜帶qepA基因，未檢測(cè)到qnrA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr、qnrS基因(見(jiàn)表6)。

表6 含耐藥基因的菌株數(shù)與耐藥菌株數(shù)的比較

2.4脈沖場(chǎng)凝膠電泳 挑取不同場(chǎng)所耐藥菌株進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，通過(guò)PFGE分析產(chǎn)生14-17條帶，條帶分子量大小范圍在20～1 100 kb之間。從圖1中可以看出，通過(guò)軟件的聚類(lèi)分析，不同場(chǎng)所分離的10株腸炎沙門(mén)氏菌可以分為4個(gè)型(同源性80%以下)，其中分離自同一場(chǎng)所的腸炎沙門(mén)氏菌呈現(xiàn)基本相同的PFGE譜型，如來(lái)自孵化場(chǎng)的C76、C58；來(lái)自屠宰場(chǎng)的MHY2、507、251；也有分離自不同養(yǎng)殖場(chǎng)的腸炎沙門(mén)氏菌呈現(xiàn)較為接近的親緣關(guān)系，如來(lái)自孵化場(chǎng)的C76、C58和屠宰場(chǎng)的MHY2、507、251；另外，同一場(chǎng)所不同PFGE譜型的有養(yǎng)殖場(chǎng)分離株:43、34、L3。

圖110株腸炎沙門(mén)氏菌的PFGE圖譜

Fig.1PFGEpatternoftenstrainsofSalmonellaenteritidis

Chicken hatchery: C76, C58, C135; Chicken farm: 43, 34, L3; Slaughterhouse: MHY2, MHJY, 507, 251; Marker:SalmonellaH9812.

3 討 論

本次研究中我們從山東省部分地區(qū)雞孵化場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰廠采集沙門(mén)氏菌樣品，經(jīng)分離、鑒定其主要血清型為腸炎沙門(mén)氏菌，這與大多數(shù)國(guó)家所分離到的優(yōu)勢(shì)血清型基本一致。美國(guó)和歐盟2010年從肉雞中分離的沙門(mén)氏菌主要以腸炎、肯塔基血清型為主[10-11]；楊保偉等[12]對(duì)陜西省2007-2008年部分零售畜禽肉沙門(mén)氏菌血清型研究顯示，雞肉源沙門(mén)氏菌以腸炎沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌為主。值得注意的是，此次研究中腸炎沙門(mén)氏菌在雞孵化場(chǎng)弱雛中分離率很高，達(dá)58.08%。由此可以看出腸炎沙門(mén)氏菌是山東省雞孵化場(chǎng)中正在盛行的高致病性沙門(mén)氏菌血清型，很可能是弱雛的致死菌。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果看，本次研究中大部分沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林和四環(huán)素產(chǎn)生了較高的耐藥性。趙愛(ài)華等[13]對(duì)2010-2011年江蘇泰州周邊地區(qū)分離的腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率分別為74.2%和64.5%，與本研究結(jié)果基本一致。廖成水等[14]的研究中氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率分別為61.22%和19.39%，明顯低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析原因可能與菌株來(lái)源、不同地區(qū)用藥情況、飼養(yǎng)管理等方面有密切關(guān)系。

細(xì)菌的耐藥機(jī)制是復(fù)雜的，其遺傳機(jī)制主要是由耐藥基因直接編碼蛋白或基因作用位點(diǎn)發(fā)生突變[15]。目前研究表明，細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物的耐藥主要是由于獲得了有關(guān)結(jié)合質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子中新的四環(huán)素耐藥基因tet。tet種類(lèi)繁多，已鑒定出30多種，其中tetA、tetB、tetC、tetD、tetG[16]等在沙門(mén)氏菌中發(fā)生率較高。Peirano[17]和Fan[18]等分別對(duì)135株沙門(mén)氏菌和107株革蘭氏陰性菌進(jìn)行分析，菌株四環(huán)素耐藥主要由tetA和tetB介導(dǎo)。本研究中124株四環(huán)素類(lèi)耐藥的菌株中有102株檢測(cè)到了tetA，與以上報(bào)道相似，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)tetB、tetC、tetD和tetG，tetA檢出率為82.25%，說(shuō)明tetA在山東省部分肉雞生產(chǎn)場(chǎng)所廣泛流行 。

細(xì)菌對(duì)青霉素類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性主要是由于產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，從而水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物酰胺環(huán)上的酰胺鍵。β-內(nèi)酰胺酶家族包括的酶類(lèi)相當(dāng)廣泛，根據(jù)基因來(lái)源和進(jìn)化關(guān)系可分為T(mén)EM型、SHV型、CTX型和OXA型等。目前，從沙門(mén)氏菌中檢測(cè)到的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因有blaTEM、blaPSE、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M等[16]。本次研究中我們從110株青霉素類(lèi)耐藥的菌株中擴(kuò)增到blaTEM基因，檢出率達(dá)88%，比廖經(jīng)忠等[19]報(bào)道的142株革蘭氏陰性腸桿菌blaTEM檢出率為59.9%這一結(jié)果要高，說(shuō)明blaTEM廣泛流行于山東省雞源腸炎沙門(mén)氏菌中，且青霉素類(lèi)耐藥主要由blaTEM基因介導(dǎo)。

細(xì)菌耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為一個(gè)世界性的難題，研究山東省食源性沙門(mén)氏菌的藥敏性特征及與耐藥性產(chǎn)生的相關(guān)基因，有助于從食物鏈的源頭和食品性動(dòng)物生產(chǎn)中采取合理的干預(yù)措施，減少和防止沙門(mén)氏菌耐藥性的產(chǎn)生，保障食品安全。同時(shí)，也對(duì)更好的了解沙門(mén)氏菌的耐藥機(jī)理和有效控制日趨嚴(yán)重的沙門(mén)氏菌耐藥性問(wèn)題提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ding MJ, Gao JY, Tang Y, et al. The isolation, identification and biological characteristics research ofSalmonellaEnteritidis from broiler[J]. China Anim Husbandry Vet Med, 2009, 36(5): 203-209. (in Chinese)

丁孟建, 高繼業(yè), 唐妤, 等. 肉雞源腸炎沙門(mén)氏菌的分離與鑒定及生物學(xué)特性觀察[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2009, 36(5) : 203-209.

[2]Xu XB, Gu BK, Ran L, et al. Sourcing research on rare serotypeSalmonelladiarrhea in Shanghai[J]. Shanghai J Prev Med, 2009, 21(1): 7-9. (in Chinese)

許學(xué)斌, 顧寶柯, 冉陸, 等. 上海市罕見(jiàn)沙門(mén)菌型腹瀉的溯源研究[J]. 上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 21(1) : 7-9.

[3]Ren XB, Tang DY, Yang ZP, et al. Progress on studies of antibiotic resistance ofSalmonellafrom swine[J]. Swine Industry Sci, 2009, 26(12): 36-39. (in Chinese)

任學(xué)兵, 湯德元, 楊澤平, 等. 豬沙門(mén)氏菌耐藥性的研究進(jìn)展[J]. 豬業(yè)科學(xué), 2009, 26(12) : 36-39.

[4]Zhang XL, Liao XG, Hao ZY, et al. Pro-active monitoring and establishment of DNA fingerprint database ofSalmonellain raw meat food in Henan Province during 2006-2007[J]. Chin J Health Lab Technol, 2009, 19(7): 1545-1548. (in Chinese)

張秀麗, 廖興廣, 郝宗宇, 等. 2006-2007年河南省生肉食品中沙門(mén)菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)及其DNA指紋圖譜庫(kù)的建立[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2009, 19(7) : 1545-1548.

[5]Biendo M, Laurans G, Thomas D, et al. Molecular characterization and mechanisms of resistance of multidrug-resistant humanSalmonellaentericaserovar typhimurium isolated in Amiens[J]. Int J Antimicrobial Agents, 2005, 26(3): 219-229. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2005.05.003

[6]Wang MY, Xu MH, Pan HW, et al. Establishment and preliminary application of LAMPinvA gene assay for rapid detection ofSalmonella[J]. Chin J Health Lab Technol, 2008, 18(10): 23-26. (in Chinese)

王敏雅, 徐明漢, 潘宏偉, 等. 沙門(mén)菌invA基因LAMP快速檢測(cè)法的建立和初步應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2008, 18(10) : 23-26.

[7]CLSI M31-A3, Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard-Third Edition[S]. USA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008: 101-110.

[8]Ng LK, Martin I, Alfa M, et al. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes[J]. Mol Cell Probes, 2001, 15(4): 209-215. DOI:10.1006/mcpr.2001.0363

[9]Yan L, Cong MW, Guo JW, et al.Prevalence of antimicrobial resistance amongSalmonellaisolates from chicken in China[J]. Food Borne Pathog Dis, 2011, 8(1): 45-53. DOI:10.1089/fpd.2010.0605

[10]USDA. National Antimicrobial Resistance Monitoring System Enteric Bacteria, Animal Arm (NARMS): 2010 NARMS Animal Arm Annual Report[R]. Athens, GA: U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, 2012: 18.

[11]Euro surveillance editorial team. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2010[J]. Euro Surveill, 2012, 17(10): 71-94.

[12]Yang BW, Zhang XL, Qu D, et al. Serotypic and genotypic characterization ofSalmonellaSerovars from retails meat in Shanxi province (2007 -2008)[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(5): 654-660. (in Chinese)

楊保偉, 張秀麗, 曲東, 等. 2007-2008陜西部分零售畜禽肉沙門(mén)氏菌血清型和基因型[J].微生物學(xué)報(bào), 2010, 50(5) : 654 -660.

[13]Zhao AH, Huan HH. The isolation ofSalmonellaEnteritidis from chicken and drug sensitivity analysis[J]. Jiangsu Agr Sci, 2012, 40(6): 207-209. (in Chinese)

趙愛(ài)華, 還紅華. 雞腸炎沙門(mén)氏菌的分離和藥物敏感性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(6) : 207-209.

[14]Liao CS, Cheng XC, Zhang CJ, et al. Antimicrobial resistance and resistance genes of pathogenicSalmonellarecently isolated from chicken[J]. Chin Vet Sci, 2011, 41(7): 751-755. (in Chinese)

廖成水, 程相朝, 張春杰, 等. 雞源致病性沙門(mén)氏菌新近分離株的耐藥性與耐藥基因[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2011, 41(7) : 751-755.

[15]Wei XL, Chen ZL. Characterization of mutations in gyrA and gyrC of clinical and experimental inductive of fluroquinolone-resistantSalmonellastrains[J]. Chin J Vet Med, 2006, 42(9): 6-8. (in Chinese)

魏秀麗, 陳杖榴. 沙門(mén)氏菌耐藥株gyrA基因和parC基因突變特征分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2006, 42(9) : 6-8.

[16]Michael GB, Butaye P, Cloeckaert A, et al. Genes and mutations conferring antimicrobial resistance inSalmonella: an update[J]. Microbes Infect, 2006, 8(7): 1898-1914. DOI:10.1016/j.micinf.2005.12.019

[17]Peirano G, Agerso Y, Aarestrup FM, et al. Occurrence of integrons and antimicrobial resistance genes amongSalmonellaEnterica from Brazil[J]. J Antimicrobial Chemother, 2006, 58(2): 305-309. DOI:10.1093/jac/dkl248

[18]Fan W, Hamilton T, Webster SS, et al. Multiplex real-time SYBR Green Ⅰ PCR assay for detection of tetracycline efflux genes of Gram-negative bacteria[J]. Mol Cell Probes, 2007, 21(4): 245-256. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.12.005

[19]Liao JZ, Liu WE, Li HL, et al. Study on drug resistance genes of TEM type β-lactamases produced by gram-negative bacteria[J]. China J Modern Med, 2010, 2(13): 1957-1966. (in Chinese)

廖經(jīng)忠, 劉文恩, 李虹玲, 等. 革蘭陰性桿菌TEM型β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 2(13): 1957-1966.