山羊源奧斯陸莫拉菌的分子鑒定與分析

張素輝,黃勇富,付利芝,沈克飛,徐登峰

奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis)為革蘭氏陰性球桿菌，是Henriksen于1967年在奧斯陸發(fā)現(xiàn)的，該菌是人和動(dòng)物黏膜上的正常菌群，可從健康成年人的鼻腔和門診病人的耳朵、咽喉、氣管、血液等分離到[1-4]。奧斯陸莫拉菌對(duì)頭孢曲松高度敏感，主要在機(jī)體抵抗力及免疫力降低時(shí)，引起呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖等多系統(tǒng)感染，同時(shí)可能導(dǎo)致腦膜炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、腹膜炎、陰道炎、骨髓炎、化膿性關(guān)節(jié)炎及菌血癥等[5]。臨床病例中有近一半患病對(duì)象是兒童[6]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于奧斯陸莫拉菌對(duì)山羊的危害還未見(jiàn)報(bào)道，本研究對(duì)重慶市某羊場(chǎng)送檢臨床肺炎病例病山羊的病原微生物進(jìn)行了分離培養(yǎng)，通過(guò)分子檢測(cè)方法鑒定，該山羊肺炎病例病原菌為奧斯陸莫拉菌。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 4只20 d齡的健康羔羊，購(gòu)自榮昌某羊場(chǎng)。

1.2試驗(yàn)試劑 小牛血清瓊脂平板培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)提供；PCR反應(yīng)試劑2×Taq PCR Master Mix、DNA抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；青霉素等20種藥敏紙片購(gòu)自自上海衛(wèi)生技術(shù)服務(wù)公司生物試劑所；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物為通用引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1.5 kb左右，由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列為：

F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，

R1492：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

1.3病原菌的分離純化 實(shí)驗(yàn)室解剖送檢肺炎病例山羊，對(duì)肺臟化膿部位進(jìn)行無(wú)菌劃線接種于普通瓊脂平板和小牛血清瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，并將分離菌進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4致病性試驗(yàn) 將分離到的病原菌接種到含有小牛血清的肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)中 ，37 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，取6 mL菌液4 000 r/min離心5 min，收集菌體，再用生理鹽水稀釋到原有濃度。選取4只健康的20日齡的羔羊，分為兩組，然后選取3只羔羊通過(guò)氣管注射上述菌液，2 mL/只，剩余的1只注射生理鹽水作為對(duì)照，觀察羔羊的健康情況。

1.5藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片法做藥敏試驗(yàn)，取200 μL菌液涂布于小牛血清培養(yǎng)基平板上，并貼上藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑。主要檢測(cè)了該菌對(duì)頭孢曲松等29種抗生素的敏感性，抑菌圈直徑<10 mm表示其對(duì)抗生素具有一定的耐藥性，10～15 mm的為中度敏感，>15 mm的為高度敏感。

1.6病原菌的16SrDNA的 PCR擴(kuò)增 取1.5 mL純培養(yǎng)菌液離心，按DNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取基因組。在PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL(50 μmol/L)，模板DNA 2 μL，加ddH2O至50 μL，在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用l0 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.7PCR產(chǎn)物的純化與測(cè)序 將預(yù)期目的條帶大小相符的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，送往大連寶生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.8系統(tǒng)進(jìn)化分析 將分離菌株16S rDNA序列與GenBank中已知的相關(guān)核酸序進(jìn)行分析比對(duì)，并利用生物軟件MEGA5通過(guò)距離法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1菌株的鏡檢及培養(yǎng)特性結(jié)果 對(duì)純化得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，短且寬，近橢圓形，單個(gè)、成對(duì)或呈短鏈狀，鏡檢結(jié)果如圖1所示。分離到的菌株在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)十分緩慢，24 h后仍觀察不到菌落，說(shuō)明該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較高；在小牛血清瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后，可觀察到直徑為2.0～2.5 mm的粘性菌落，如圖2所示。

圖1 革蘭氏染色結(jié)果

圖2菌落圖片

Fig.2Bacterialcolony

(10× object glass)

2.2致病性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組的3只羔羊被接種病原菌以后，均在7 d左右開(kāi)始發(fā)病，體溫升高到40 ℃～42 ℃，出現(xiàn)眼、鼻黏膜變紅，發(fā)干，流鼻液、咳嗽、喘氣等呼吸道癥狀，無(wú)死亡現(xiàn)象，對(duì)照組的山羊無(wú)異常癥狀。對(duì)實(shí)驗(yàn)組的羊只進(jìn)行肺臟病原菌的分離鑒定，通過(guò)革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)分離到大量革蘭氏陰性短桿菌，菌體呈單個(gè)、成對(duì)，亦有短鏈狀。

圖3 電泳結(jié)果

1: PCR amplification products of 16SrDNA;

M: DNA marker

2.3藥敏試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)分離的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)頭孢曲松等19種抗生素的敏感性較高，對(duì)甲氧芐啶等4種抗生素為中度敏感，對(duì)紅霉素等6種抗生素敏感性較弱，表現(xiàn)出一定的抗性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4菌株16S rDNA序列的擴(kuò)增與鑒定 利用通用引物對(duì)該菌進(jìn)行16SrDNA的擴(kuò)增，得到大小為1 447 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，電泳結(jié)果如圖3所示；擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列測(cè)序結(jié)果如圖4所示。

表1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

Note: S--High sensitive; M--Medium sensitive; R--Resistant.

圖4 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.5系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果 將該菌的16SrDNA序列在GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與菌株JN084136同源性達(dá)99.9%。將該序列與相關(guān)菌屬奈瑟氏菌屬(Neisseria)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、俊片菌屬(Lampropedia)、副球菌屬(Paracoccus)的代表菌株16S rDNA進(jìn)行序列比對(duì)分析，各代表菌株相關(guān)信息如表2，并利用生物軟件MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化結(jié)果如圖5所示。

表2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的代表菌株及16rDNA序列信息表

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代細(xì)菌分類鑒定從傳統(tǒng)的表型分類進(jìn)入基因型分類水平，16S rDNA分析技術(shù)已成為研究生命系統(tǒng)進(jìn)化及細(xì)菌分類的常用工具，16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析技術(shù)通過(guò)比較細(xì)菌核糖體DNA片段的同源性實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的分類學(xué)鑒定，理論上具有很好的可靠性[7]。本研究基于16S rDNA序列的同源性的比對(duì)表明，分離到的病原菌與各代表菌株的同源性均較高，其中與菌株JN084136同源性高達(dá)99.9%；通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)分離菌株與Moraxella的代表菌株聚為一簇，Neisseria和Lampropedia位于另一分支，與實(shí)驗(yàn)分離菌株進(jìn)化距離最近的菌株是Moraxellaosloensis(JN084136)，由此可以確定該分離菌為奧斯陸莫拉菌[8-9]。同時(shí)為今后奧斯陸莫拉菌性肺炎的PCR快速診斷方法的建立及該病的防治研究提供了可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

目前，在國(guó)內(nèi)關(guān)于奧斯陸莫拉菌以及它對(duì)山羊的生理機(jī)能危害的報(bào)道相對(duì)較少，可能的原因是該菌致病性不強(qiáng)，不會(huì)引起動(dòng)物大規(guī)模的死亡，沒(méi)有得到人們特別關(guān)注；或者是該病原菌可能對(duì)針對(duì)肺炎病例的藥物較為敏感，相對(duì)易于治愈；同時(shí)該菌的對(duì)生長(zhǎng)條件要求較為嚴(yán)格，不易分離。而且該病原菌引起的肺炎病例易與溶血性巴氏桿菌、支原體等病原引起的呼吸道病癥相混淆，故目前臨床上暫無(wú)奧斯陸莫拉菌致山羊疾病病例的報(bào)道。健康動(dòng)物機(jī)體抵抗力較強(qiáng)時(shí)，不會(huì)因感染該病原菌而患病，當(dāng)機(jī)體體抗力低下時(shí)，該菌會(huì)引發(fā)類似肺炎的癥狀，本次試驗(yàn)對(duì)羊只接種的菌的濃度較大，導(dǎo)致羊只出現(xiàn)了一定癥狀。奧斯陸莫拉菌可以造成人獸共患病，其對(duì)人體的危害還有待于進(jìn)一步研究。

圖5基于16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)狀圖(Moraxellaosloensis(#)為分離病原菌)

Fig.5Phylogenetictreebasedon16SrDNAsequences(Moraxellaosloensis(#)isthepathogenicbacterium)

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