生長分化因子9在卵泡生長發(fā)育中的調控

曹明雅（綜述），趙志明（審校）

（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科，河北 石家莊 050000）

生長分化因子9在卵泡生長發(fā)育中的調控

曹明雅（綜述），趙志明*（審校）

（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科，河北 石家莊 050000）

生長分化因子9；卵泡；卵母細胞；綜述文獻

生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF-9）是卵源性的生長因子，亦是由卵母細胞通過旁分泌方式產生，在卵泡生長和發(fā)育的調節(jié)中具有重要作用，屬于轉化生長因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）超家族?，F(xiàn)對GDF-9在卵泡生長發(fā)育中的調控作用、甾體激素的合成及其在不孕治療過程中對卵母細胞質量的影響等進行綜述。

1 GDF-9的結構與表達部位

GDF-9是TGF-β超家族的成員之一。人類GDF-9基因定位于5q31.3上，含有1.6kb的內含子及2個外顯子，與已知的該家族其他成員相比，具有高度同源性的GDF-9多肽序列由包括1～27個氨基酸編碼的信號肽序列、318個氨基酸殘基的前結構域和含有135個殘基的成熟結構域共454個氨基酸組成。但GDF-9的成熟結構域僅有6個保守的半胱氨酸殘基，而TGF-β家族中有7個保守的半胱氨酸殘基，因此GDF-9是以異源二聚體形式存在還是共價結合的同源二聚體形式存在仍存在爭議，有待進一步研究。

GDF-9主要由卵巢產生并表達于特定細胞而發(fā)揮作用。但在人類及不同物種之間其表達的時間和定位不同。人類的性腺組織及非性腺組織中均可表達GDF-9mRNA［1］。在靈長類動物的卵巢中，卵母細胞、丘顆粒細胞以及壁層顆粒細胞中均有GDF-9表達。一篇以成年雌性恒河猴為研究對象的文獻也報道［2］，在促性腺激素高峰至排卵期間，GDF-9表達于所有的卵母細胞、丘顆粒細胞及其腔壁顆粒細胞，并且還檢測到了GDF-9蛋白在卵泡液中也有表達。與之相反，在嚙齒類動物中則顆粒細胞上未檢測到GDF-9的表達而僅于卵母細胞上檢測到。對體外培養(yǎng)的人類顆粒細胞采用定量逆轉錄－聚合酶鏈反應與免疫印跡法（Western Blot）檢測發(fā)現(xiàn)其也可表達GDF-9。

2 GDF-9與卵泡的發(fā)育

卵泡的發(fā)育主要由2個階段構成，即不依賴促性腺激素階段（主要是指原始卵泡和初級卵泡階段）和依賴促性腺激素階段（主要是指竇卵泡階段）。對正常的卵泡發(fā)育來說，GDF-9是必需的，并且通過特異性表達于人類及大多數(shù)哺乳動物的卵巢組織而與其一同維持卵巢功能并發(fā)揮作用。

2.1 GDF-9對原始卵泡及竇前卵泡的調控：卵泡發(fā)育由原始卵泡的卵母細胞產生GDF-9開始。對于早期卵泡發(fā)育GDF-9是必需的，缺失GDF-9的雌性小鼠其卵泡發(fā)育大多停滯在初級卵泡（單層顆粒細胞）階段［3］。在人類的卵巢組織中加入重組GDF-9進行體外培養(yǎng)后，大量的始基卵泡啟動生長，卵泡閉鎖減少，卵泡更多的存活、生長并發(fā)育至次級卵泡階段［4］。這說明GDF-9不僅能夠對原始卵泡的募集進行誘導，還能夠促進初級卵泡過渡到小竇前卵泡期。對未發(fā)育成熟的大鼠給予重組GDF-9后，大鼠的卵巢質量增加，初級卵泡數(shù)及小竇前卵泡數(shù)也增加，分別為30%和60%，而原始卵泡的數(shù)量減少了29%［5］。此外，GDF-9還對早期卵泡的進一步生長與分化起著重要作用，卵母細胞分泌的內源性GDF-9是一種重要的有絲分裂原。

應用RNA干擾技術體外阻斷GDF-9由竇前卵泡過渡到竇卵泡期的表達，無論是竇前卵泡的基礎發(fā)育還是卵泡刺激素誘導下的發(fā)育均受阻；可能原因是 GDF-9被阻斷后，細胞凋亡蛋白酶 3（Caspase-3）被激活，而激活Caspase-3促使竇前卵泡發(fā)生凋亡。相反，增加外源性GDF-9則可以對竇前卵泡發(fā)育起促進作用而對抗Caspase-3對其促凋亡的作用。因此，GDF-9可能通過這種對竇前卵泡抗凋亡的調控，在其向早期竇卵泡的生長發(fā)育過程中起到促進作用［6］。

2.2 GDF-9對促性腺激素依賴階段卵泡的調控：在該階段，影響卵泡發(fā)育的主要因素有卵泡膜細胞、顆粒細胞、卵丘及卵母細胞，GDF-9正是通過對這些細胞發(fā)揮作用而影響卵泡發(fā)育的。GDF-9對顆粒細胞的增殖有明顯促進作用［7－8］。同時，GDF-9亦能夠給予卵母細胞最適宜生長的內環(huán)境，這是通過調節(jié)卵丘擴展中起關鍵作用的酶的活性，有利于形成含豐富透明質酸的細胞外基質實現(xiàn)的。另外，重組GDF-9直接上調和卵丘膨脹相關的透明質酸酶2及前列腺素內過氧化物酶2、腫瘤壞死因子誘導蛋白6及正五聚蛋白 3的合成，而使尿激酶纖溶酶原激活物mRNA合成被抑制，GDF-9對這些基因表達的調控，最終影響了卵丘的擴張及晚期卵泡的發(fā)育［］。

3 GDF-9對顆粒細胞影響

卵源性GDF-9能夠刺激小竇卵泡至排卵前卵泡的顆粒細胞增生［10］，因此，顆粒細胞是其重要的靶細胞。對大鼠進行體外研究，發(fā)現(xiàn)GDF-9反義核苷酸可以下調顆粒細胞上促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）受體mRNA的表達，使基礎狀態(tài)以及促卵泡生成素刺激下的竇前卵泡的生長被抑制，同時還可以激活細胞蛋白凋亡酶增加竇前卵泡的凋亡，但外源性GDF-9的加入可以對抗該作用。加入GDF-9后卵泡的發(fā)育數(shù)增加，GDF-9通過激活GDF-9磷脂酸激酶3通路，抑制顆粒細胞的凋亡和閉鎖，從而保護顆粒細胞免受凋亡，促進竇前到竇卵泡的生長。這一結果提示顆粒細胞上FSH受體發(fā)生異常，使其對FSH受體的反應性下降，從而影響竇前期和早竇狀卵泡的生長，是由于GDF-9缺陷造成，因此FSH受體要正常發(fā)揮作用足量的GDF-9是必需的［11］。反之，F(xiàn)SH也能調節(jié)GDF-9受體的表達，還能調節(jié)環(huán)氧合酶 2（環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX-2）表 達，并 且 雌 二 醇（estradiol，E2）和FSH協(xié)同增強 GDF-9受體在培養(yǎng)的顆粒細胞中的表達［12－13］，從而影響顆粒細胞的增殖、分化，卵丘的擴散，類固醇激素的合成以及卵母細胞的成熟排卵和黃體化。

將卵丘顆粒細胞包裹的卵母細胞去除明顯增加了丘顆粒細胞凋亡率，而加入裸卵則顯著降低其凋亡率，并且發(fā)現(xiàn)丘顆粒胞的凋亡率與其跟卵母細胞之間的距離呈梯度增加的關系，這說明卵丘顆粒細胞的凋亡與卵母細胞分泌的某些細胞因子有關，GDF-9可能通過促進顆粒細胞中蛋白激酶B磷酸化抑制顆粒細胞凋亡［14］。

4 GDF-9對卵母細胞的影響

GDF-9缺乏的卵母細胞不能進行減數(shù)分裂［15］。對GDF-9缺失的小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，其卵泡大多于初級階段停止發(fā)育，觀察超微結構顯示卵母細胞的高爾基體發(fā)生異常，核周細胞器呈退化表現(xiàn)，皮質激素無法正常合成，與周圍細胞之間異常的縫隙連接，穿越透明帶時減少的微管，最終導致卵周隙損害，使卵母細胞死亡。同時，GDF-9的缺失還可以間接影響卵母細胞從生長、發(fā)育至成熟的過程，主要是通過上調抑制素α（存在于卵泡顆粒細胞上）及kit配體的表達而實現(xiàn)［16］。由于卵母細胞與顆粒細胞之間存在雙向聯(lián)系，所以卵母細胞可以通過調節(jié)顆粒細胞的功能來調控卵泡內的微環(huán)境，從而滿足其自身生長的需要。促性腺激素可以促進正常卵母細胞中GDF-9的產生。由于這種卵源性因子的參與，卵母細胞和卵丘細胞之間形成了雙向的調節(jié)，推測其表達水平異?？赡苡绊懧涯讣毎亚饛秃象w的結構和功能，從而導致卵母細胞質量和發(fā)育潛能受損［3］。

5 GDF-9激素合成

GDF-9可以影響卵巢內的卵泡膜細胞上類固醇激素合成。將小鼠的GDF-9基因敲除，則其卵泡膜細胞分化缺陷，存在于卵泡膜上的促黃體生成素（luteotropic，LH）受體、ckit受體（Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員）和17α-羧化酶等分化標志物缺乏，從而阻礙卵泡膜細胞的分化，但在給予外源性GDF-9后，用 Western Blot法測定卵巢勻漿中的17α-羧化酶量，發(fā)現(xiàn)顯著增加。表明GDF-9還能夠通過影響卵巢卵泡膜細胞類固醇激素和相關因子的產生，影響卵泡的發(fā)育和分化。GDF-9影響卵泡類固醇激素的生成，尤其對卵泡膜細胞功能的調節(jié)具有重要作用［2］。

GDF-9可通過調節(jié)FSH的活性而影響FSH對顆粒細胞的作用［17］。在顆粒細胞未分化前，GDF-9調節(jié)顆粒細胞的生長，主要是通過降低FSH的生物學效應，避免顆粒細胞提前黃素化實現(xiàn)。在小竇卵泡發(fā)育至排卵前卵泡階段，GDF-9對雌孕激素的生成及FSH刺激下的顆粒細胞生長起促進增強的作用，同時又抑制顆粒細胞的分化，并降低FSH、胰島素生長因子Ⅰ、8.Br.環(huán)磷酸腺苷和FSH共同刺激下的包括E2、孕酮（progesterone，P）、細胞色素p450膽固醇側鏈裂解酶和細胞色素芳香化酶p450、類固醇生成急性調節(jié)蛋白以及淋巴細胞歸巢受體等甾體激素的生成［2］，這提示GDF-9可能是一種來源于卵巢，對避免生長卵泡中的顆粒細胞過早分化起抑制作用的黃素化抑制因子。相反，當顆粒細胞已被FSH／LH激活至排卵前，GDF-9則可以使其分化狀態(tài)發(fā)生改變，上調其下游靶基因COX-2基因及前列腺素受體mRNA的表達水平，促進卵丘細胞上孕激素的合成［18］。

6 GDF-9與輔助生殖

目前，促排卵治療在不孕癥中的應用主要是通過對促卵泡生成素敏感的竇前卵泡以及竇卵泡應用促性腺激素，從而使其募集到更多進入發(fā)育池，但對于促卵泡生成素不敏感的竇前及竇卵泡則沒有有效方法。近年來，隨著對GDF-9在卵泡生長、發(fā)育和成熟過程中的作用以及其表達調控機制的研究日益深入，是否可以考慮對促性腺激素反應不敏感的患者，通過外源性給予GDF-9以促進卵泡的發(fā)育，而促使體內對促性腺激素發(fā)生反應的卵泡數(shù)量增加來解決上述問題。另外，未成熟卵的體外培養(yǎng)在技術上還存在諸多問題，如卵母細胞成熟度不高、受精率低、胚胎發(fā)育潛能欠佳、與正常胚胎比細胞卵裂時更易發(fā)生阻滯和延遲等。在動物卵母細胞體外培養(yǎng)體系中進一步發(fā)現(xiàn)，外源性加入卵源性因子可以提高囊胚形成率和胎兒存活率［6］。此外，有些研究已經(jīng)嘗試在人類或哺乳動物某一階段卵泡的體外培養(yǎng)中加入重組的具有生物活性的GDF-9，結果發(fā)現(xiàn)其對早期卵泡的生長有促進作用［19］。GDF9表達水平變化有望成為卵母細胞胞質成熟和細胞質量的評價指標。

綜上所述，GDF-9是由卵母細胞分泌，并通過自分泌、旁分泌的方式作用于卵巢，協(xié)同維持卵巢的生殖和內分泌功能，通過影響顆粒細胞增殖、卵丘擴展、激素合成、降低顆粒細胞凋亡率等影響卵母細胞的質量，從而影響體外受精－胚胎移植妊娠率。

［1］SHI FT，CHEUNG AP，HUANGHF，et al.Effects of endogenous growth differentiation factor 9on activin A-induced inhibin B production in human granulosa-lutein cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94（12）：5108－5116.

［2］DE RESENDE LO，VIREQUE AA，SANTANA LF，et al.Single-cell expression analysis of BMP15 and GDF9 in mature oocytes andBMPR2incumuluscellsofwomen with polycystic ovary syndrome undergoing controlled ovarian hyperstimulation［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29（10）：1057－1065.

［3］GILCHRISTRB，LANEM，THOMPSONJG.Oocytesecreted factors：regulators of cumulus cell function and oocyte quality［J］.Hum Reprod Update，2008，14（2）：159－177.

［4］VASCONCELOS GL，SARAIVA MV，COSTA JJ，et al.Effects of growth differentiation factor-9 and FSH on in vitro development，viabilityandmRNA expressioninbovine preantral follicles［J］.Reprod Fertil Dev，2013，25（8）：1194－1203.

［5］HOANG YD，MCTAVISH KJ，CHANG RJ，et al.Paracrine regulation of theca androgen production by granulosa cells in the ovary［J］.Fertil Steril，2013，100（2）：561－567.

［6］HUSSEIN TS，THOMPSON JG，GILCHRIST RB，et al.Oocyte-secreted factors enhance oocyte developmental competence［J］.Develop Biol，2006，296（2）：514－521.

［7］KIMH，YAMANOUCHIK，MATSUWAKIT，etal.Induction of Ski protein expression upon luteinization in rat granulosa cells without a change in its mRNA expression［J］.J Reprod Dev，2012，58（2）：254－259.

［8］SáNCHEZ F，ROMERO S，ALBUZ FK，et al.In vitro follicle growth under non-attachment conditions and decreased FSH levels reduces Lhcgr expression in cumulus cells and promotes oocyte developmental competence［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29（2）：141－152.

［9］AKISON LK，ALVINO ER，DUNNING KR，et al.Transient invasive migration in mousecumulusoocytecomplexes induced at ovulation by luteinizing hormone［J］.Biol Reprod，2012，86（4）：125.

［10］SPIEER LJ，AAD PY，ALLEN D，et al.Growth differentiation factor-9 has divergent effects on proliferation and steroidogenesis of bovine granulosa cells［J］.J Endocrinol，2006，189（2）：329－339.

［11］ORISAKA M，ORISAKAS，JIANG JY，etal.Growth differentiation factor 9 is antiapoptotic during follicular development from preantral to early antral stage［J］.Mol Endocrinol，2006，20（10）：2456－2468.

［12］PANGAS SA.Bone morphogenetic protein signaling transcription factor（SMAD）function in granulosa cells［J］.Mol Cell Endocrinol，2012，356（1／2）：40－47.

［13］JAYAWARDANA BC，SHIMIZU T，NISHIMOTO H，et al.Hormonal regulation of expression of growth differentiation factro-9 receptor typeⅠ andⅡ genes in the bovine ovarian follicle［J］.Reproduction，2006，131（3）：545－553.

［14］楊曉葵，宋蕊，王樹玉.FSH和GDF-9對大鼠顆粒細胞蛋白激酶B表達的影響［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18（3）：37－38.

［15］SIMPSON CM，STANTONPG，WALTONKL，etal.Activation of latent human GDF9 by a single residue change（Gly 391 Arg）in the mature domain［J］.Endocrinology，2012，153（3）：1301－1310.

［16］LIU G，SHI F，BLAS-MACHADO U，et al.Dietary galactose inhibits GDF-9 mediated follicular development in the rat ovary［J］.Reprod Toxicol，2006，21（1）：26－33.

［17］MILENKOVIC M，DIAZ-GARCIA C，WALLIN A，et al.Viability and function of the cryopreserved whole rat ovary：comparison between slow-freezing and vitrification［J］.Fertil Steril，2012，97（5）：1176－1182.

［18］KAIVO-OJA N，BONDESTAM J，K?M?R?INEN M，et al.Growth differentiation factor-9 induces Smad2 activation and inhibin B production in cultured human granulosa-luteal cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88（2）：755－762.

［19］VASCONCELOS GL，SARAIVA MV，COSTA JJ，et al.Effects of growth differentiation factor-9 and FSH on in vitro development，viabilityandmRNA expression in bovine preantral follicles［J］.Reprod Fertil Dev，2013，25（8）：1194－1203.

（本文編輯：許卓文）

R711.75

A

1007-3205（2014）10-1231-04

2014－01－20；

2014－02－24

曹明雅（1986－），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院醫(yī)學碩士研究生，從事生殖醫(yī)學研究。

*通訊作者。E-mail：zhaozhiming73＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.045