二十碳五烯酸玻璃體注射治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究

董白霞，葉存喜，包永琴，姚一民，魏玉華，楊 欣

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050000）

二十碳五烯酸玻璃體注射治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究

董白霞，葉存喜，包永琴，姚一民，魏玉華，楊 欣

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050000）

目的 探討二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是否有效。方法 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)產(chǎn)生增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）動(dòng)物模型24只。隨機(jī)分為D組（背景期給藥組）12只、E組（增殖前期給藥組）8只、F組（增殖期給藥組）4只，玻璃體注射EPA，應(yīng)用眼底熒光血管造影（fluorescence fundus angiography，F(xiàn)FA）、CD105免疫組織化學(xué)光鏡觀察眼底病變及陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化，并與前期建立的PDR動(dòng)物模型進(jìn)行比較。結(jié)果 FFA結(jié)果顯示，E組給藥后2周內(nèi)效果最佳，而D組給藥后8周內(nèi)均有效，隨時(shí)間延長(zhǎng)藥效不斷增強(qiáng)；E組給藥后6周時(shí)效果差于D組給藥后2、4、8周時(shí)；與未用藥組相比，在相同的病程時(shí)均未觀察到視網(wǎng)膜新生血管。F組給藥后仍可觀察到視網(wǎng)膜新生血管形成，并且DR也沒(méi)有明顯減輕。CD 105免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，相同的病程內(nèi)，D組和E組未觀察到CD 105陽(yáng)性的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，但F組仍觀察到CD 105陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)論 EPA可以在DR背景期和增殖前期封閉VEGF受體flk-1，阻斷DR的發(fā)展。

視網(wǎng)膜疾??；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類(lèi)；熒光血管造影

目前尚缺乏安全、經(jīng)濟(jì)、有效的藥物用于增殖性糖尿 病 性 視 網(wǎng) 膜 病 變 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）的治療。尋求此類(lèi)藥物已成為眾多學(xué)者研究和關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是人體正常飲食中不可缺少的不飽和脂肪酸，Yang等［1］研究證實(shí)，EPA可抑制體外培養(yǎng)的牛頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。我們前期研究證明，EPA可抑制體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［2］。但有人認(rèn)為EPA對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變有促進(jìn)作用［3］。因此，本研究選用已建立的PDR模型［4］，根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)得出的有效 EPA濃度和劑量［2］，在糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）不同時(shí)期給予EPA治療，觀察EPA在不同時(shí)期給藥的治療效果，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源、選擇及分組：選擇8周齡健康SD大鼠31只，雌雄各半，體質(zhì)量180～250g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。31只鼠腹腔注射鏈脲佐菌素

（streptozotocin，STZ）（60mg／kg，用0.01mol／L的枸櫞酸鹽緩沖液溶解、濃度為 10g／L），1周后測(cè)血糖（美國(guó)強(qiáng)生血糖儀）≥13.9mmol／L確定為糖尿病鼠［5］，之后每周測(cè)血糖 1次，血糖＜13.9mmol／L鼠淘汰出糖尿病組，共注射31只，成模24只，成模率為77.4%。24只糖尿病大鼠采用隨機(jī)方法分為 3組。①D組（背景期給藥組）12只，注射STZ后1個(gè)月時(shí)846復(fù)合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內(nèi)注射全麻后，雙眼玻璃體注射血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）0.5μL（美國(guó)Sigma公司）＋EPA 0.5μL（美國(guó)Cayman公司）＋生理鹽水1.0μL。②E組（增殖前期給藥組）8只，注射STZ后1個(gè)月時(shí)846復(fù)合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內(nèi)注射全麻后，雙眼玻璃體注射VEGF 0.5μL＋生理鹽水1.5μL，2周后雙眼玻璃體液射EPA 0.5μL＋生理鹽水1.5μL。③F組（增殖期給藥組）4只，注射STZ后1個(gè)月時(shí)846復(fù)合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內(nèi)注射全麻后，雙眼玻璃體注射VEGF 0.5μL＋生理鹽水1.5μL，4周后雙眼玻璃體注射EPA 0.5μL＋生理鹽水1.5μL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 眼底熒光血管造影（fluorescence fundus angiography，F(xiàn)FA）檢查：玻璃體注射VEGF后第2周（D1亞組）、4周（D2、E1亞組）、8周（D3亞、E2亞、F組）各選3只鼠846復(fù)合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內(nèi)注射全麻后20%熒光素鈉0.1mL腹腔注射，行雙眼FFA檢查，觀察眼底病變程度。

1.2.2 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察：每組3只動(dòng)物FFA后，左側(cè)頸動(dòng)脈注射碳素墨汁后處死，摘除左眼球做組織切片，觀察其視網(wǎng)膜微血管對(duì)碳素顆粒的滲漏程度；摘除右眼球做組織切片，行CD105免疫組織化學(xué)染色，觀察有無(wú)增殖的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 FFA造影結(jié)果：D1組3只鼠FFA可見(jiàn)背景熒光增強(qiáng)，其中2只鼠可見(jiàn)視網(wǎng)膜出血（圖1）；D2組3只鼠均可見(jiàn)背景熒光增強(qiáng)，其中2只鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜大血管扭曲變形和毛細(xì)血管擴(kuò)張，1只鼠出現(xiàn)了視網(wǎng)膜內(nèi)出血（圖 2），未觀察到視網(wǎng)膜新生血管；D3組3只鼠可觀察到血管熒光素滲漏，無(wú) 1例觀察到視網(wǎng)膜新生血管。E1組中 1只可見(jiàn)到視網(wǎng)膜大血管扭曲和毛細(xì)血管擴(kuò)張、滲漏，2只鼠觀察到背景熒光的增強(qiáng)；E2組3只鼠均可觀察到視網(wǎng)膜出血、無(wú)1例觀察到視網(wǎng)膜新生血管。F組3只鼠均觀察到背景熒光的增強(qiáng)和視網(wǎng)膜內(nèi)出血（圖3，4），有 1只發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜新生血管（圖5）。

2.2 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察：光鏡觀察視網(wǎng)膜血管滲漏情況及免疫組織化學(xué)CD 105標(biāo)記視網(wǎng)膜新生血管。D1組中2只鼠觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網(wǎng)膜切片CD 105免疫組織化學(xué)染色均為陰性。D2組中1只鼠可觀察到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層大血管有碳素顆粒的滲漏；3只鼠視網(wǎng)膜切片CD105免疫組織化學(xué)染色均為陰性。D3組中均未觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網(wǎng)膜切片CD 105免疫組織化學(xué)染色均為陰性。E1組中1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網(wǎng)膜切片 CD 105免疫組織化學(xué)染色均為陰性。E2組，1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網(wǎng)膜切片CD105免疫組織化學(xué)染色均為陰性。F組，3只鼠均觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；1只鼠視網(wǎng)膜切片CD105免疫組織化學(xué)染色為陽(yáng)性，觀察到視網(wǎng)膜前膜（圖6）。

3 討 論

隨著糖尿病患者數(shù)量在世界范圍內(nèi)的與日俱增，DR已經(jīng)成為生后最常見(jiàn)的致盲原因。90%以上的糖尿病患者最終會(huì)發(fā)生視網(wǎng)膜病變，其中 1型糖尿病患者中有60%、2型糖尿病患者中有20%會(huì)發(fā)展為PDR［6］。由于目前的治療方法——光凝和玻璃體切除術(shù)勢(shì)必會(huì)帶來(lái)?yè)p害并且只在短期內(nèi)有效，考慮到糖尿病患者的數(shù)量近年來(lái)持續(xù)增加，探索新的治療方法迫在眉睫。

VEGF是造成DR新生血管形成的關(guān)鍵性因子，阻斷其作用理論上可以抑制DR的發(fā)生和發(fā)展。目前在脈絡(luò)膜新生血管性疾病的研究中已有3種藥物應(yīng)用于臨床研究階段，即 Macugen、Lucentis、Avastin。上述3種藥物價(jià)格昂貴，均屬于VEGF抗體類(lèi)藥物，可否用于治療視網(wǎng)膜的新生血管性疾病尚有爭(zhēng)議。

EPA作為VEGF受體 flk-1的封閉劑［7］，理論上可以達(dá)到阻斷DR的效果［8］；另外，它還是人體中所必須的一種不飽和脂肪酸，廣泛存在于深海魚(yú)油中，對(duì)生物體無(wú)毒、無(wú)不良反應(yīng)，開(kāi)發(fā)前景廣闊。近年來(lái)，EPA受到越來(lái)越多國(guó)外學(xué)者的關(guān)注。已有研究［1］表明，EPA在體內(nèi)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，在體外對(duì)VEGF誘導(dǎo)的牛頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖有抑制作用，故其在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制之一有可能是選擇性抑制VEGF受體flk-1，從而抑制腫瘤的新生血管形成。我們的研究結(jié)果也表明，當(dāng)EPA濃度達(dá)到0.15g／L時(shí)，可以抑制體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［2］。但對(duì)于EPA體內(nèi)應(yīng)用對(duì)DR的治療作用尚存在爭(zhēng)議［3］。因此，我們研究了EPA體內(nèi)應(yīng)用對(duì)DR的作用。

從本實(shí)驗(yàn)FFA結(jié)果與前期研究［4］結(jié)果比較來(lái)看，D1組3只鼠（3／3）FFA可見(jiàn)背景熒光增強(qiáng)，其中2只鼠（2／3）可見(jiàn)視網(wǎng)膜出血，與前期研究中相同病程未治療組（C1組）發(fā)生視網(wǎng)膜出血的概率相同；D2組3只鼠均可見(jiàn)背景熒光增強(qiáng)，其中2只鼠（2／3）出現(xiàn)視網(wǎng)膜大血管扭曲變形和毛細(xì)血管擴(kuò)張，1只鼠（1／3）出現(xiàn)了視網(wǎng)膜內(nèi)出血，可見(jiàn)視網(wǎng)膜出血的發(fā)生率比C1、D1組的發(fā)生率降低了，而視網(wǎng)膜血管扭曲變形和毛細(xì)血管擴(kuò)張這種比出血輕微的病變發(fā)生率增加了，說(shuō)明DR的病情延緩了；未觀察到視網(wǎng)膜新生血管，說(shuō)明EPA治療組在注射VEGF后4周仍未發(fā)生增殖性的病變。D3組3只鼠（3／3）可觀察到血管熒光素滲漏，但無(wú)1例觀察到視網(wǎng)膜新生血管，既無(wú)增殖性病變的發(fā)生，又較D1、D2組病變減輕。上述情況表明，背景期治療可以延緩背景期DR的病變進(jìn)展，給藥后8周效果優(yōu)于4周，4周時(shí)又優(yōu)于2周，同時(shí)阻止了增殖性病變的發(fā)生。E1組1只鼠（1／3）可見(jiàn)到視網(wǎng)膜大血管扭曲和毛細(xì)血管擴(kuò)張、滲漏，而無(wú)1例觀察到視網(wǎng)膜出血，說(shuō)明E1組DR病變比D1組減輕；2只鼠（2／3）觀察到背景熒光的增強(qiáng)，較D1組發(fā)生率（3／3）降低；也就是說(shuō)，增殖前期治療在給藥后2周內(nèi)DR的病變程度較背景期治療組明顯減輕；D2組有 1例出血，E1組無(wú)1例出血，僅有1只鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜大血管扭曲和毛細(xì)血管擴(kuò)張、滲漏；E1組2只鼠背景熒光增強(qiáng)，發(fā)生率低于D2組（3／3）。上述結(jié)果表明，增殖前期治療組注射VEGF后4周不僅沒(méi)有發(fā)生前期研究中相同病程未治療組（C2組）的新生血管，而且DR病變程度也輕于D2組（背景期治療組注射VEGF后4周）；E2組3只鼠均可觀察到視網(wǎng)膜出血（3／3），無(wú) 1例觀察到視網(wǎng)膜新生血管；雖未出現(xiàn)增殖性病變，但BDR病變的程度較D1、D2、D3、E1組重。說(shuō)明增殖前期治療組在給藥后6周時(shí)的效果已明顯減退，差于同期給藥后 2周和背景期給藥后 2、4、8周的效果。由此可見(jiàn)，增殖前期治療組給藥后的 2周內(nèi)EPA作用效果最明顯，而在背景期治療組給藥后8周內(nèi)均有效，隨時(shí)間延長(zhǎng)效果增強(qiáng)，分析原因可能是大鼠玻璃體為不液化玻璃體，藥物進(jìn)入玻璃體后完全吸收所需時(shí)間長(zhǎng)，故出現(xiàn)上述現(xiàn)象；而在增殖前期給藥組中，由于此階段VEGF水平高，需要足夠的藥物來(lái)封閉受體，所以同樣劑量的EPA被充分消耗，才會(huì)出現(xiàn)在給藥后6周時(shí)作用較差、但仍有效的結(jié)果。F組3只鼠（3／3）均觀察到背景熒光的增強(qiáng)和視網(wǎng)膜內(nèi)出血，有1只（1／3）發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜新生血管。表明視網(wǎng)膜出血的發(fā)生率在F組增加，還有新生血管出現(xiàn)，說(shuō)明增殖期治療組已有的PDR不能逆轉(zhuǎn)，非PDR的發(fā)展也無(wú)減輕，這種結(jié)果與EPA是VEGF受體封閉劑有關(guān)。

其次，從光鏡觀察視網(wǎng)膜血管滲漏情況及免疫組織化學(xué)CD 105標(biāo)記視網(wǎng)膜新生血管的情況來(lái)看，D1組2只鼠觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏D2組1只鼠可觀察到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層大血管碳素顆粒的滲漏，D3組均未觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏。說(shuō)明隨給藥后時(shí)間的延長(zhǎng)，DR病變程度在減輕，與FFA觀察到的結(jié)果一致；E1組1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏，E2組1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏，2組與C1組比較均例數(shù)減少。說(shuō)明治療有效，E1和E2組比較在視網(wǎng)膜血管對(duì)碳素顆粒的滲漏上病變無(wú)減輕或加重，與FFA結(jié)果有出入，考慮是否與樣本例數(shù)少有關(guān)。上述結(jié)果更進(jìn)一步印證了FFA得出的結(jié)論：不論在增殖前期治療還是在背景期治療均能減輕BDR的病變；背景期治療效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而漸好，而增殖前期治療后2周時(shí)效果明顯，6周時(shí)效果減退。各組CD105免疫組織化學(xué)結(jié)果均呈陰性，表明背景期和增殖前期給予EPA玻璃體注射治療DR，均有效地阻止了PDR的發(fā)生。F組3只鼠均觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏，1只鼠視網(wǎng)膜切片CD105免疫組織化學(xué)染色為陽(yáng)性，觀察到視網(wǎng)膜前膜，與FFA結(jié)果一致，從而進(jìn)一步印證了FFA的結(jié)果。

綜上所述，EPA對(duì)臨床可見(jiàn)的DR血管增殖性病變存在著確切的治療作用，不同時(shí)期給予EPA治療的效果不同：在背景期給藥后2、4、8周時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)DR的治療效果越來(lái)越明顯，并能阻止增殖性血管病變的發(fā)生；在增殖前期給藥后2周時(shí)，對(duì)減輕DR背景期病變的治療效果優(yōu)于 6周時(shí)，同樣能阻止增殖性血管病變的發(fā)生。增殖期給予EPA治療后不能阻止PDR血管性病變進(jìn)展。（本文圖見(jiàn)封二）

［1］YANG SP，MORITA I，MUROTA SI.Eicosapentaenoic acid attenuates vascular endothelial growth factor-induced proliferation via inhibiting Flk-1 receptor expression in bovine carotid artery endothelial cells［J］.J Cell Physiol，1998，176（2）：342－349.

［2］董白霞，馬景學(xué)，葉存喜，等.二十碳五烯酸對(duì)體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的研究［J］.中華眼科雜志，2007，43（8）：726－733.

［3］HAMMES HP，WEISS A，F(xiàn)üHRER D，et al.Acceleration of experimental diabetic retinopathy in the rat by omega-3 fatty acids［J］.Diabetologia，1996，39（3）：251－255.

［4］董白霞，馬景學(xué)，葉存喜，等.增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型的建立［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（12）：1218－1222.

［5］BARBER AJ，ANTONETTI DA.Mapping the blood vessels with paracellular permeability in the retinas of diabetic rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（12）：5410－5416.

［6］RAKOCZY PE，BRANKOV M，F(xiàn)ONCECA A，et al.Enhanced recombinant adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor expression in the adult mouse retina：a potential model for diabetic retinopathy［J］.Diabetes，2003，52（3）：857－863.

［7］MORITA I.Regulation of angiogenesis-expression of VEGF receptors［J］.Hum Cell，1998，11（4）：215－220.

［8］OZAKI H，SEO MS，OZAKI K，et al.Blockade of vascular endothelial cell growth factor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization［J］.Am J Pathol，2000，156（2）：697－707.

（本文編輯：許卓文）

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部

IN VIVORESEARCH ON TREATMENT OF PROLIFERATIVE DIABETIC RETINOPATHY BY EICOSAPENTAENOIC ACID INTRAVITREOUSLY

DONG Baixia，YE Cunxi，BAO Yongqin，YAO Yimin，WEI Yuhua，YANG Xin
（Department of Ophthalmology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050000，China）

ObjectiveTo identify the utility of eicosapentaenoic acid（EPA）on diabetic retinopathy（DR）in vivo.MethodsProliferative diabetic retinopathy（PDR）Sprague-Dawley rat（n＝24）was induced by application of streptozotocin associated with vascular endothelial growth factor（VEGF）.Sprague-Dawley rats were randomly divided into D group（n＝12）representing medication administration group at background DR stage，E group（n＝ 8）representing medication administration group at pre-proliferation DR stage，F(xiàn) group（n＝4）representing medication administration group at proliferation DR stage，then EPA was injected intravitreously.Fundus pathological changes were observed by fluorescence fundus angiography（FFA），CD105 positive retinal vascular endothelial cells were observed by microscope with immunohistochemistry technique.The results were compared with diabetic rat models established in our prior study.ResultsFFA demonstrated the best effect in E group in two weeks after EPAinjection，whereas effective and augmented time-dependently in D group during eight weeks after EPA injection.In six weeks after EPA injection in E group，the effect decreased obviously as compared with that 2，4，8 weeks after EPA injection in D group.As compared with nonmedication group，retinal neovascularization was not detected at the same course of this disease.Retinal neovascularization was also detected and diabetic retinopathy was not relieved in EPA injected eyes in F group.CD105 immunohistochemistry described there were no CD105 positive vascular endothelial cells at the same course of disease in D and E group.But CD105 positive cells were still observed in F group.ConclusionEPA can suppress DR development by blocking VEGF receptor flk-1.

retinal diseases；vascular endothelial growth factors；fluorescein angiography

R774.1

A

1007-3205（2014）10-1148-04

2014－02－22；

2014－04－02

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院院基金資助項(xiàng)目（2h1200601）

董白霞（1975－），女，河北河間人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事眼外傷、眼底病診治研究。

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.010