RAP80在DNA損傷反應(yīng)中的作用

郝瑋瑋，宋銳鋒，曾引才，徐 峰

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 河南鄭州 450052)

DNA在遭受電離輻射、類輻射性藥物、化學(xué)損傷等刺激后會(huì)發(fā)生DNA雙鏈斷裂(Double-strand break，DSB)，此時(shí) DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)調(diào)控激活一系列細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、DNA修復(fù)網(wǎng)絡(luò)并促使凋亡反應(yīng)發(fā)生，以確保精確修復(fù)損傷位點(diǎn)，維持基因的完整性。許多研究報(bào)道，受體相關(guān)蛋白80(receptor-associated protein 80，RAP80)在DNA損傷反應(yīng)中有著重要作用，可促使一系列修復(fù)蛋白定位到正確的DNA損傷位點(diǎn)。現(xiàn)對(duì)RAP80在DNA損傷反應(yīng)中的作用綜述如下。

1 RAP80的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 RAP80的結(jié)構(gòu) RAP80定位于人類染色體5q35，基因片段全長(zhǎng)超過(guò)90 kb，具有15個(gè)外顯子及14個(gè)內(nèi)含子，編碼一個(gè)含有719個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為79.6 kDa的蛋白。RAP80一級(jí)結(jié)構(gòu)的N末端有兩個(gè)核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)，在 C末端還有第三個(gè)NLS，其中N末端第二個(gè)NLS對(duì)其在細(xì)胞核內(nèi)定位起著關(guān)鍵性的作用。激光共聚焦顯微鏡也發(fā)現(xiàn) RAP80主要以斑點(diǎn)型分布于細(xì)胞核內(nèi)［1］。RAP80蛋白羧基端包含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，氨基端包含兩個(gè)泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motifs，UIM)的核內(nèi)蛋白。在電離輻射族誘導(dǎo)的損傷中，UIM及204-304氨基酸區(qū)是RAP80重新定位所必需的［2］。現(xiàn)已在多種蛋白內(nèi)發(fā)現(xiàn)有UIM結(jié)構(gòu)，其在細(xì)胞胞吞、泛素化和 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等方面均有重要作用［3-4］。

1.2 RAP80的功能 2002年，首次克隆分離出RAP80，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)于睪丸及卵巢，此外在乳腺、心臟等器官也大量表達(dá)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RAP80可與類固醇激素核受體超家族成員RTR結(jié)合，并調(diào)節(jié)部分發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)［1］。近期又有研究表明RAP80通過(guò)依賴激動(dòng)劑的方式與雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)作用，并可調(diào)節(jié) ERα 的轉(zhuǎn)錄活性［5］。此外還發(fā)現(xiàn)，RAP80可與泛素相關(guān)小修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier，SUMO)結(jié)合酶 UBC9結(jié)合而被SUMO化，但SUMO化后的RAP80與DDR信號(hào)傳導(dǎo)的作用尚不知曉［6］。目前關(guān)于RAP80的研究主要集中于DNA損傷修復(fù)定位。

2 RAP80與DNA損傷修復(fù)定位

DSB發(fā)生時(shí)，為確?；蛲暾院图?xì)胞定位損傷位點(diǎn)，通過(guò)周期停滯修復(fù)DNA及細(xì)胞凋亡，對(duì)DNA損傷產(chǎn)生反應(yīng)。在DNA受到損傷后，一系列DDR相關(guān)的蛋白迅速結(jié)合，并聚集在細(xì)胞核損傷灶周?chē)?，該定位過(guò)程涉及多種嚴(yán)格控制的翻譯后修飾手段，包括乙?；⒘姿峄?、泛素化，SUMOA化等。近來(lái)，一種腫瘤抑制基因(也被稱為乳腺癌易患基因)BRCA1在DNA損傷修復(fù)、維持基因完整性及細(xì)胞的正常發(fā)育中所起的作用日益受到重視。而在其作用過(guò)程中涉及一系列蛋白，包括 CCDC98/Abraxas，RAP80，MDC1，RNF8 和UBC13等，其中RAP80在損傷后的定位過(guò)程中起關(guān)鍵作用［7-8］。

以電離輻射導(dǎo)致的損傷灶(ionizing radiation-induced foci，IRIF)為例。DNA損傷后，共濟(jì)失調(diào)—毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia-telangiectasia mutated geng，ATM基因)可快速磷酸化組蛋白 H2A亞型H2AX的C末端，此磷酸化H2AX(即γ-H2AX)在DSBs產(chǎn)生后數(shù)秒即開(kāi)始出現(xiàn)，10 min達(dá)到高峰。有研究表明，在H2AXC末端磷酸化位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，一系列與調(diào)節(jié)及修復(fù)有關(guān)的蛋白無(wú)法大量正確定位于IRIF［9］。這說(shuō)明 γ-H2AX在 DDR相關(guān)蛋白定位于IRIF起著重要作用。DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)介質(zhì)1(DNA damage checkpoint 1，MDC1)的 C末端區(qū)包含兩個(gè)BRCA1的 C末端結(jié)構(gòu)區(qū)(BRCA1 C-terminal repeat，BRCT)，N末端區(qū)包含一個(gè)叉狀頭部區(qū)(forkhead-associated，F(xiàn)HA)。通過(guò) BRCT結(jié)構(gòu)域，MDC1可與 γ-H2AX的C末端磷酸肽結(jié)合，這樣MDC1可以保護(hù)γ-H2AX去磷酸化而提高其DNA修復(fù)功能;此外，MDC1可通過(guò)其FHA結(jié)構(gòu)域與ATM相互作用，從而促使更多的ATM聚集在DSBs周?chē)⑹笻2AX磷酸化，通過(guò)該機(jī)制可使DNA損傷信號(hào)放大［10］。一旦DSB發(fā)生，在斷裂處H2AX就會(huì)發(fā)生磷酸化，形成γ-H2AX。然后MDC1這一適配體蛋白就會(huì)直接與γ-H2AX結(jié)合，這一步驟是細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)的關(guān)鍵。隨后 RAP80、CCDC98/Abraxas及RNF8發(fā)生一系列轉(zhuǎn)錄后修飾的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以促使BRCA1定位到IRIF。有研究表明，RAP80在 DSB發(fā)生90～120 min后才重新定位于DNA損傷位點(diǎn)［2］，這說(shuō)明RAP80是作為DNA損傷反應(yīng)信號(hào)的下游調(diào)節(jié)者而發(fā)揮作用，其具體作用機(jī)制如下。

2.1 RAP80結(jié)構(gòu)中的UIM功能 泛素化是一種重要的蛋白質(zhì)修飾，其通過(guò)特異性地降解蛋白質(zhì)，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、調(diào)控轉(zhuǎn)錄、參與DNA損傷應(yīng)答等。UIM不僅可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白單泛素化而影響其活性及功能，并且可通過(guò)識(shí)別單泛素化及多泛素化序列，而調(diào)節(jié)蛋白分子內(nèi)及分子間的相互作用。RAP80氨基端包含兩個(gè)UIM，其可直接結(jié)合泛素而促進(jìn)RAP80的多泛素化過(guò)程。有研究表明，在電離輻射時(shí)缺失UIM的RAP80突變體無(wú)法定位于DNA損傷位點(diǎn)［8-9］;UIM基序中重要的氨基酸發(fā)生突變，RAP80則無(wú)法形成IRIF［11］。這些表明DSB發(fā)生時(shí)，RAP80及下游相關(guān)蛋白是通過(guò)RAP80結(jié)構(gòu)中的UIM與泛素化相關(guān)蛋白作用，從而在損傷灶重新定位。

2.2 RAP80與細(xì)胞周期 RAP80可通過(guò)招募形成BRCA1-BARD1-BRCC36復(fù)合物定位于IRIF，來(lái)調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)信號(hào)的傳導(dǎo)。有研究表明，敲除RAP80表達(dá)可提高細(xì)胞對(duì)IR引起凋亡的敏感性，減少細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)的活性，損傷G2/M期檢查點(diǎn)的調(diào)控作用［8-9］。

2.3 RAP80與BRCA1作用 BRCA1是一種重要的DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白，它參與了DNA損傷修復(fù)過(guò)程，特別是在此過(guò)程中需要泛素的參與。BRCA1有一個(gè)關(guān)鍵的C末端結(jié)構(gòu)域BRCT(carboxyl-terminal domain of BRCA1)，該結(jié)構(gòu)域在突變修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。BRCT為一個(gè)磷酸化肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以與磷酸化的蛋白質(zhì)有效結(jié)合，特別是對(duì)含有pSer-X-XPhe序列的蛋白質(zhì)結(jié)合能力更強(qiáng)。約50%的家族乳腺癌患者和20%～30%的遺傳性卵巢癌患者BRCA1基因發(fā)生突變，且大部分突變發(fā)生于BCRT結(jié)構(gòu)域［11-12］。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌及卵巢癌患者BRCT結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變者BRCA1則無(wú)法與RAP80結(jié)合，這表明RAP80與BRCA1結(jié)合發(fā)揮作用需要BRCT結(jié)構(gòu)域的作用。

然而RAP80并不包含可與BRCT結(jié)合的pSer-XX-Phe序列，這表明RAP80與BRCA1并不是通過(guò)直接結(jié)合而發(fā)揮作用，而是需要其它BRCT結(jié)合蛋白的輔助作用。隨后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)一種新型蛋白CCDC98，可以與BRCA1中的BRCT通過(guò)pSer-X-X-Phe而有效結(jié)合［13］。重要的是正是這種結(jié)合使RAP80被有效招募到BRCA1附近而形成復(fù)合體，從而參與對(duì)DNA損傷的修復(fù)，同時(shí)RAP80可以輔助BRCA1在IRIF發(fā)生后定位于準(zhǔn)確的損傷位點(diǎn)。

BRCA1作為最早發(fā)現(xiàn)的乳腺癌抑制基因，它的突變可導(dǎo)致乳腺癌等相關(guān)腫瘤發(fā)生率明顯升高，而RAP80是作為BRCA1發(fā)揮作用時(shí)的一個(gè)重要伴侶蛋白。低BRCA1、低Rap80水平的患者，其中位生存期顯著延長(zhǎng)，這說(shuō)明Rap80對(duì)腫瘤化療效果可能起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用［14］。

2.4 RAP80磷酸化 大部分參與IR導(dǎo)致的DNA損傷的蛋白均被ATM磷酸化［15］。RAP80也包含8個(gè)潛在的ATM磷酸化位點(diǎn)。已有報(bào)到證實(shí)其中3個(gè)(Ser101，Ser205，Ser402)在體外被 ATM 磷酸化［2，8，16］。但在不同的種屬中，這些磷酸化的位點(diǎn)并非高度保守著。在UV引起的DNA損傷中，RAP80可被ATR磷酸化而發(fā)揮作用，這些表明RAP80在不同形式的DNA損傷中及細(xì)胞周期調(diào)控中均起著重要作用［12］。IR發(fā)生5 min后，RAP80即發(fā)生磷酸化，這一過(guò)程遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于其定位于正確的損傷位點(diǎn)，其早期的磷酸化是否有著特殊的調(diào)節(jié)功能尚未明了。磷酸化可以影響蛋白之間的相互作用及蛋白的功能，但RAP80的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)發(fā)生突變，并不影響RAP80與BRCA1的定位，據(jù)此可認(rèn)為在IRIF發(fā)生時(shí)RAP80的定位并不依賴于ATM的磷酸化。因此，在DDR中RAP80的磷酸化可能有著尚未知曉的額外作用。

3 研究展望

由于RAP80在IRIF引起的DNA損傷修復(fù)中起著重要作用，因此目前關(guān)于其研究多集中于DNA修復(fù)及是否可成為新的腫瘤易感基因等方面。研究證實(shí)，大約5%～10%的不同類型腫瘤患者血清中含有RAP80抗體，因此可認(rèn)為RAP80是一種新的腫瘤相關(guān)抗原［17］，而關(guān)于RAP80的其它功能如泛素化及轉(zhuǎn)錄等，研究較少。有研究表明在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)RAP80可減少ERα蛋白因泛素化作用而發(fā)生的降解，從而提高ERα蛋白水平以及ERα靶基因pS2的轉(zhuǎn)錄活性［5］。這些說(shuō)明RAP80可能是ERα的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而ERα與多種腫瘤的發(fā)生均有密切關(guān)系，ERα的活化可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移。因此，RAP80很可能通過(guò)改變ERα蛋白水平和轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而促進(jìn)其下游基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。這些為研究RAP80在腫瘤發(fā)生中的作用提供了新的方向。而RAP80在腫瘤中所起的作用也有待于進(jìn)一步的研究。

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