細(xì)菌生物膜形成及相關(guān)耐藥性治療研究進(jìn)展

溫紹霞，孫 競(jìng)

(1.十堰市西苑醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000；

2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000)

細(xì)菌生物膜形成及相關(guān)耐藥性治療研究進(jìn)展

溫紹霞1，孫 競(jìng)2

(1.十堰市西苑醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000；

2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000)

生物膜是細(xì)菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中為了適應(yīng)周?chē)h(huán)境而形成的一種保護(hù)性生存狀態(tài)。細(xì)菌以生物膜形式存在時(shí)其耐藥性明顯增加。近些年來(lái)，廣譜抗生素的廣泛使用伴隨著細(xì)菌生物膜的形成，給臨床治療帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。本文就當(dāng)前生物膜形成過(guò)程、調(diào)控機(jī)制及相關(guān)治療措施等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

細(xì)菌生物膜；耐藥性；形成過(guò)程；調(diào)控機(jī)制；治療措施

感染性疾病與傳染性疾病是目前導(dǎo)致人類(lèi)死亡的重要病因。在細(xì)菌感染過(guò)程中，與其致病力密切相關(guān)的主要包括各種毒力因子。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)除此之外，生物膜的形成也是很多細(xì)菌致病性與產(chǎn)生耐藥性的原因之一。對(duì)于肺炎克雷伯菌，很多臨床分離株在體外和體內(nèi)都能夠形成生物膜，肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性與細(xì)菌在聚苯乙烯及呼吸道上皮細(xì)胞上的粘附力相關(guān)。

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而粘附于物體或活性組織表面，并包被于其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖基質(zhì)中形成的一種與浮游細(xì)菌生長(zhǎng)方式完全不同的細(xì)菌微生物群落，是細(xì)菌的特殊存在形式。許多細(xì)菌形成生物膜形成后所表達(dá)的基因產(chǎn)物與浮游細(xì)菌不同，細(xì)菌的生理狀態(tài)以及形態(tài)[1]也不相同，這使它的適應(yīng)能力比浮游細(xì)菌更強(qiáng)。生物膜是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境而采取的一種生存策略，是抵抗機(jī)體防御和限制抗菌藥物接近細(xì)菌的天然屏障。生物膜的形成一方面促進(jìn)細(xì)菌逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用[2]，阻礙細(xì)胞吞噬或減少吞噬作用與氧活性降低后的應(yīng)激反應(yīng)；另一方面可以阻止或延緩藥物的滲透，生物膜內(nèi)細(xì)菌的生理學(xué)特點(diǎn)影響了細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性[3]。

由于某些致病菌主要是在人體內(nèi)外和醫(yī)療材料表面形成細(xì)菌生物膜，抗生素可以殺滅浮游細(xì)菌，而處于細(xì)菌生物膜深處的細(xì)菌卻難以被清除，這也是慢性感染性疾病發(fā)作反復(fù)和難以控制的原因之一。例如在肺炎克雷伯菌致病過(guò)程中，由于生物膜的形成致使感染經(jīng)常呈現(xiàn)靜止期與急性發(fā)作期交替、易復(fù)發(fā)、難根治等特點(diǎn)。細(xì)菌生物膜的形成已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，本文將就生物膜形成過(guò)程，調(diào)控機(jī)制及相關(guān)治療措施等方面的研究進(jìn)展綜述。

1 細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程及調(diào)控機(jī)制

生物膜是細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)被它裹在其自身分泌的多聚物種所形成的一種特殊的細(xì)菌群落，具有高度的組織性與系統(tǒng)性。生物膜的形成是多因子共同作用的結(jié)果。無(wú)論微生物表型的結(jié)構(gòu)如何，以及涉及的細(xì)菌種類(lèi)如何復(fù)雜，生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的高度依賴(lài)于環(huán)境信號(hào)的過(guò)程，整個(gè)過(guò)程包括開(kāi)始、成熟、維護(hù)和分解四個(gè)階段[4]。在生物膜形成過(guò)程中，細(xì)菌首先粘附于固體的表面，這樣才能夠形成成熟的生物膜，因此細(xì)菌生物膜從游離的單個(gè)細(xì)胞到形成成熟的生物膜的重要階段是開(kāi)始吸附到附著物表面。隨著微菌落的不斷形成以及細(xì)菌的粘附并定植在宿主皮膚、黏膜上皮細(xì)胞，然后侵入組織細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，分泌水、胞外多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，將其本身包裹其中，生物膜不斷增厚，發(fā)展成熟。雖然生物膜一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，但是它仍屬于一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，生物膜聚集和成熟之后，其中有一小部分細(xì)胞可能會(huì)離開(kāi)成熟的生物膜，并將其擴(kuò)散傳播到遠(yuǎn)處，因此，在生物膜傳播相關(guān)感染中細(xì)菌生物膜的分離釋放具有重要的作用[5]。胡金樹(shù)等[6]認(rèn)為細(xì)菌從細(xì)菌生物膜脫離，主要依靠外界的作用力，或者自我分離播散到其他環(huán)境，從而引起感染。

生物膜的形成是高度依賴(lài)于基因調(diào)控集網(wǎng)絡(luò)浮游生物之間的轉(zhuǎn)換。這些網(wǎng)絡(luò)集成環(huán)境通過(guò)適當(dāng)?shù)膫鞲邢到y(tǒng)觸發(fā)的信號(hào)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，包括雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與密度感應(yīng)系統(tǒng)等(QS系統(tǒng))。雙組分系統(tǒng)(TCS)和EC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要信號(hào)是由細(xì)菌監(jiān)測(cè)外部和內(nèi)部的刺激（例如營(yíng)養(yǎng)素、離子、溫度、氧化還原狀態(tài)），并把這些信號(hào)轉(zhuǎn)換成自適應(yīng)反應(yīng)。QS系統(tǒng)也稱(chēng)為密度感應(yīng)系統(tǒng)，是細(xì)菌感受菌體密度的一種環(huán)境感應(yīng)系統(tǒng)。密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)生物膜的形成及維持具有重大意義，它可以使生物膜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酶、代謝產(chǎn)物和廢物正常的運(yùn)輸和排出，而且整個(gè)細(xì)菌群體行為也需要通過(guò)密度感應(yīng)系統(tǒng)來(lái)控制并協(xié)調(diào)，共同對(duì)周?chē)h(huán)境刺激做出反應(yīng)，整個(gè)細(xì)菌群體的生存能力得到極大的提高。QS系統(tǒng)通過(guò)自分泌的小分子信號(hào)調(diào)節(jié)生物膜形成[7-8]。AHL是已被證實(shí)的革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的生物膜細(xì)胞間信息傳遞分子，在形成和維持細(xì)菌生物膜的三維結(jié)構(gòu)中，AHL起著關(guān)鍵作用。高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)是這類(lèi)化合物的共同特征，不同細(xì)菌都含有相同的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，而?；鶄?cè)鏈中的碳鏈長(zhǎng)度(從4到18個(gè))和第三位上的基因(氫，羥基，羧基)決定該類(lèi)信號(hào)分子對(duì)細(xì)菌的不同調(diào)控作用[9]。當(dāng)多個(gè)細(xì)菌集中在一個(gè)部位時(shí)，由于環(huán)境濃集，AHL的濃度會(huì)升高，達(dá)到一定閾值時(shí)，可以與細(xì)胞內(nèi)的蛋白受體結(jié)合并激活受體，調(diào)節(jié)細(xì)菌體的某些功能基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌分泌出構(gòu)成胞外基質(zhì)的糖蛋白復(fù)合物，形成細(xì)菌生物膜完整的結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)的信號(hào)分子是產(chǎn)生修飾后寡肽，信號(hào)識(shí)別系統(tǒng)的組成是雙組分磷酸激酶，當(dāng)信號(hào)識(shí)別分子膜上激酶識(shí)別后，引起氨基酸殘基磷酸化，由天冬氨酸殘基傳遞，磷酸基因被傳遞給受體蛋白，于是此受體蛋白與DNA特定靶點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控QS系統(tǒng)。革蘭氏陽(yáng)性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)可對(duì)多種細(xì)菌行為進(jìn)行調(diào)控，如枯草芽胞桿菌的產(chǎn)芽胞、肺炎球菌中致病基因的表達(dá)。

2 細(xì)菌生物膜感染的耐藥性

由于生物膜細(xì)菌與浮游細(xì)菌不同，其耐藥性也不一樣，生物膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性低于游離狀態(tài)。

周潔等[10]認(rèn)為細(xì)菌耐藥機(jī)制有以下一種或幾種原因：(1)抗生素對(duì)生物膜滲透限制性：各種分子在生物膜的類(lèi)型包括EPS和DNA構(gòu)成了一個(gè)抗菌屏障。研究表明喹諾酮類(lèi)藥物可以很快進(jìn)入到銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌生物膜的深部[11-12]，反復(fù)、長(zhǎng)期使用利于細(xì)菌啟動(dòng)內(nèi)酰胺酶的表達(dá)，使耐藥發(fā)生突變，水解內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素。(2)生物膜中微生物的異質(zhì)性：生物膜內(nèi)化學(xué)微環(huán)境存在差異，生物膜內(nèi)由表及里的氧氣濃度、pH值、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及滲透壓存在梯度變化，決定了其內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素表現(xiàn)出不同的敏感性[13]，使生物膜表現(xiàn)出耐藥性。(3)生物膜生長(zhǎng)模式的生理變化性：Adams等[14]發(fā)現(xiàn)有rpos表達(dá)陽(yáng)性的E.coli生物膜有大量的高密度活性細(xì)菌，這可能是由于細(xì)菌在缺乏營(yíng)養(yǎng)或聚集較多的有毒代謝物質(zhì)等條件下生長(zhǎng)緩慢，rpos基因被激活。細(xì)菌生物膜中有一部分細(xì)菌分化為類(lèi)芽胞生長(zhǎng)狀態(tài)，這類(lèi)亞群細(xì)菌具有廣譜的耐藥性。此外，近年來(lái)研究表明，生物膜內(nèi)細(xì)菌可通過(guò)主動(dòng)外排機(jī)制及細(xì)菌間的感應(yīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)抗生素與細(xì)菌體內(nèi)的作用位點(diǎn)，從而在生物膜抗藥機(jī)制中有一定的作用。生物膜通過(guò)減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生、誘導(dǎo)補(bǔ)體轉(zhuǎn)化等方式對(duì)抗機(jī)體免疫防御。王云英等[15]曾報(bào)道肺炎克雷伯菌細(xì)菌生物膜抑制THP-ITLR2蛋白水平的表達(dá)，TLR2激活抗原呈遞細(xì)胞能力降低，減少細(xì)胞因子(TL-8和TL-12)和化學(xué)激活因子的產(chǎn)生，使機(jī)體免疫功能下降。

綜上所述，細(xì)菌生物膜耐藥性的產(chǎn)生可能是多方面因素共同作用的結(jié)果，主要依據(jù)不同發(fā)展階段的生物膜，菌種(株)的不同及抗生素的類(lèi)型而定。

3 細(xì)菌生物膜相關(guān)感染的防治

3.1 抗菌生物材料 細(xì)菌生物膜的形成大多與生物醫(yī)學(xué)材料有關(guān)，在生物膜材料中加入抗菌藥物可抑制表面生物膜的形成，用鑄膜的方法在形成硅膠的前提下加入利福平，可明顯抑制硅膠表面表皮葡萄球菌粘附和生長(zhǎng)[16]。選用低表面能材料（如特氟龍、高彈力硅膠或聚烏拉坦等）可使生物膜相關(guān)的感染發(fā)生率降低。聚乙二醇是親水聚合物排斥體積及反滲透壓均很大，可以產(chǎn)生強(qiáng)的抗細(xì)菌粘附能力，常被用來(lái)做表面改良劑[17-18]。經(jīng)聚乙二醇涂附的生物材料對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌有很好的抗菌作用。

3.2 抑制細(xì)菌QS系統(tǒng) 不同的細(xì)菌在不同群體感應(yīng)系統(tǒng)，如葡萄球菌有Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)。銅綠假單胞菌有l(wèi)asR和rhlR群體感應(yīng)系統(tǒng)，N-?；呓z氨酸內(nèi)脂作為群體感應(yīng)信號(hào)，除了參與生物膜的合成外，還與細(xì)菌素性因子的產(chǎn)生、抗生素的合成或降解、質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移等多種生物功能有關(guān)，并且可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡[19]，是導(dǎo)致細(xì)菌持續(xù)或反復(fù)感染的重要分子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氨溴索下調(diào)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯以及N-?；呓z氨酸內(nèi)酯合成酶編碼的基因的表達(dá)，并且能增強(qiáng)抗生素對(duì)細(xì)菌生物膜的滲透作用[20]，還能破壞成熟的細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)[21]。因此，抑制細(xì)菌的群體感應(yīng)信號(hào)，將成為控制感染合成新型抗菌藥物的重要方法。

3.3 抗生素藥物 氟喹諾酮類(lèi)藥物與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物聯(lián)合使用可以有效抑制細(xì)菌合成多糖蛋白復(fù)合物，從而抑制生物膜的形成。對(duì)于慢性感染中的生物膜，Wallwork等[22]研究發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)治療鼻竇炎有效。但是由于生物膜具有獨(dú)特的耐藥性，埋藏的細(xì)菌能抵抗抗生素，在體內(nèi)繼續(xù)存在，導(dǎo)致感染再次發(fā)作，造成患者病情反復(fù)，難以治愈。

3.4 中草藥 中草藥可抑制細(xì)菌生物膜的形成，與抗生素聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)抗生素的抗感染能力，并且中藥價(jià)格低廉，來(lái)源廣泛，毒副作用小，不容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，在菌體內(nèi)作用廣，藥理效應(yīng)多，在防治細(xì)菌生物膜引起的感染方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?？讜x亮等[23]研究了黃芩水煎液聯(lián)合左氧氟沙星或頭孢他啶對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的作用，結(jié)果顯示黃芩水煎液可抑制，破壞銅綠假單胞菌生物膜，并且與左氧氟沙星或頭胞他啶聯(lián)用后生物膜內(nèi)活菌數(shù)量減少，表明黃芩水煎液本身破壞細(xì)菌生物膜，同時(shí)對(duì)左氧氟沙星和頭孢他啶有增效作用。本課題組經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終濃度為30μg/ml黃芩素可減慢肺炎克雷伯菌生長(zhǎng)速度，減少肺炎克雷伯菌對(duì)載體的吸附，抑制和清除肺炎克雷伯菌細(xì)菌生物膜。

3.5 超聲 實(shí)驗(yàn)研究表明，低頻超聲結(jié)合抗生素可有效增強(qiáng)抗生素治療游離細(xì)菌及生物膜細(xì)菌感染的活性[24]。Qian等[25]報(bào)道了應(yīng)用低強(qiáng)度超聲輻照銅綠假單胞菌24 h后，發(fā)現(xiàn)超聲能顯著增強(qiáng)抗生素活性對(duì)抗生物膜，提高其抗菌活性。

3.6 其他 抗體作為一類(lèi)主要的蛋白質(zhì)藥物目前應(yīng)用的較為廣泛，Anti-asialoGM抗體能降低銅綠假單胞菌在肺囊纖維化上皮細(xì)胞的粘附[26]。而人類(lèi)免疫球蛋白IgG能降低銅綠假單胞菌在隱形眼鏡和角膜細(xì)胞表面的粘附[27]。段高飛等[28]研究發(fā)現(xiàn)一種海洋弧菌胞外多糖，其不僅能夠抑制細(xì)菌生物膜的形成，還能破壞逐漸形成的生物膜，增加抗生素對(duì)生物膜細(xì)菌的殺滅效果，作用更加廣泛。

4 結(jié) 語(yǔ)

細(xì)菌生物膜存在于慢性感染及植入裝置相關(guān)性感染中，盡管人們應(yīng)用多種方法來(lái)防治細(xì)菌生物膜感染，并取得了一定的成效，但是隨之而來(lái)的是可能會(huì)帶來(lái)“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)。因此，隨著對(duì)細(xì)菌生物膜的深入研究，今后防治生物膜感染的研究方向不應(yīng)只集中控制細(xì)菌生物膜的形成，而應(yīng)針對(duì)細(xì)菌生物膜感染的發(fā)病過(guò)程研究更好的治療方法。

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1003—6350（2014）09—1331—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0512

2013-10-21)

溫紹霞。E-mail：2603384011@qq.com