連翹子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

魏惠華， 郭 靜， 黃孝春， 賈建華， 玄振玉

(蘇州玉森新藥開發(fā)有限公司， 江蘇 蘇州 215123)

連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)，為中醫(yī)常用的清熱解毒藥，歷來被視為瘡家要藥，其性微寒，味苦。具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功能。秋季果實(shí)初熟尚帶綠色時采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干，習(xí)稱“青翹”，篩取種子，習(xí)稱“連翹心，連翹子”。中醫(yī)用于清心熱、治療熱病、心煩、不寐等癥?！稖夭l辨》卷一記載的清宮方及其加減方治療太陰溫病，神昏譫語者?，F(xiàn)代臨床報道使用連翹心治療呃逆[1]。對連翹子化學(xué)成分的研究，目前尚不多見，但已有報道連翹子中連翹酯苷的量明顯高于青翹及老翹[2-11]。連翹子中油類成分α-蒎烯、?-蒎烯、松油烯-4-醇、α-檸檬烯等和果皮揮發(fā)油所含化學(xué)成分基本一致，種子中揮發(fā)油含有量高于果皮，約為果皮的10倍[12-15]?！吨袊幍洹?010年版一部收載的連翹藥材分為青翹和老翹兩種[16]，連翹按青翹采收，基本能保留連翹子，而按老翹采收，則其中的連翹子往往被當(dāng)作雜質(zhì)而除去，這導(dǎo)致了連翹子這一寶貴藥材資源的大量浪費(fèi)。

本實(shí)驗為了更好地控制連翹子質(zhì)量，對連翹子的顯微鑒別、薄層鑒別和成分測定進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Sartorius BS110S分析天平(萬分之一級)；硅膠G薄層預(yù)制板(青島海洋化工廠)；美國Agilent系列HPLC色譜儀包括Agilent 1100 series，G1314 VWD檢測器，Agilent色譜工作站；756 CRT紫外-可見分光光度計；BM 1000顯微鏡(江南永新光學(xué)有限公司)；SX2-4-10型箱式電阻爐(上海亞明熱處理設(shè)備公司)。

1.2 試藥 甲醇(HPLC，TEDIA公司出品)；冰醋酸，石油醚、乙酸乙酯、丙酮(分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；連翹酯苷A對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111810-201102，純度為93.2%)；連翹子均購自安徽省亳州市厚樸藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)可燕老師鑒定為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 本品橫切面：種皮表皮為1列細(xì)胞組成，細(xì)胞方形或四方形，排列整齊，外壁稍增厚，內(nèi)含油滴；下層為數(shù)列不規(guī)則薄壁細(xì)胞。胚乳細(xì)胞含糊粉粒和脂肪油滴。粉末棕褐色。種皮表皮細(xì)胞表面觀細(xì)胞呈多角形，垂周壁平直，略增厚，內(nèi)含油滴；橫切面觀細(xì)胞呈正方形或長方形，長70～150 μm，寬70～98 μm，排列整齊。胚乳細(xì)胞含糊粉粒和脂肪油滴。見圖1。

圖1 連翹子橫切面圖及粉末圖

2.2 薄層色譜鑒別 取本品粉末1.5 g，加石油醚(30～60 ℃)50 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去濾液，藥渣揮干，加50%甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加50%甲醇10 mL使溶解，作為供試品溶液。另取連翹酯苷A對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄IV B)試驗，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(5∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

1.連翹酯苷A 2～11.連翹子藥材

2.3 揮發(fā)油、水分、灰分、浸出物檢查 根據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測定甲法、IX H水分測定第二法、IX K灰分測定法，X A浸出物測定法對10批連翹子藥材進(jìn)行檢查，結(jié)果見表1。

表1 不同批連翹子揮發(fā)油、水分、灰分、浸出物檢查

2.4 連翹酯苷A測定

2.4.1 色譜條件 Global-SP-120-5-C18-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-水-冰醋酸(33∶67∶0.2)為流動相；檢測波長為332 nm；體積流量為1.0 mL/min。理論塔板數(shù)按連翹酯苷A峰計算應(yīng)不低于8 000。

2.4.2 對照品溶液的制備 取干燥至恒重的連翹酯苷A對照品10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容搖勻；精密量取上述母液1 mL置10 mL量瓶中，加50%甲醇定容搖勻，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約1.5 g，精密稱定，加石油醚50 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去濾液，藥渣揮干，精密加入50%甲醇40 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，加50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL至25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。

2.4.4 系統(tǒng)適用性試驗 在上述確立的色譜條件基礎(chǔ)上，分別精密吸取“2.4.2”項下對照品溶液及“2.4.3”供試品溶液各10 μL，對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，計算結(jié)果表明，5次峰面積的RSD為0.2%，拖尾因子為1.15。理論塔板數(shù)按連翹酯苷A計算為10 021，分離度10.66。

2.4.5 專屬性試驗 分別取空白溶劑、對照品、連翹子供試品注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測定，結(jié)果溶劑無干擾，方法專屬性好，見圖3。

1.連翹酯苷A

2.4.6 線性關(guān)系 精密稱取連翹酯苷A對照品10.02 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，連翹酯苷A對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計算，得回歸方程為y=1 463.4x-11.586，r=0.999 9，連翹酯苷A在0.046 7～0.747 1 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，RSD為0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足測定要求。

2.4.8 重復(fù)性試驗 平行取同批樣品6份(批號20120325)，按供試品制備方法處理，測定。結(jié)果連翹酯苷A平均含有量為2.93%，RSD為0.9%。表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.9 中間精密度試驗 使用不同型號的高效色譜儀，由不同人員于不同時間進(jìn)行試驗。實(shí)驗結(jié)果表明，12份樣品測定結(jié)果的RSD為1.0%，表明精密度良好。

2.4.10 加樣回收率試驗 取本品粉末(批號20120325，連翹酯苷A含有量為2.93%)9份，每份0.75g，分別加入對照品約17.6、22.0、26.4mg各3份，按“2.4.3”項下制備供試品溶液。按上述色譜條件測定連翹酯苷A，計算準(zhǔn)確度，本方法平均回收率為100.3%，RSD為1.9%。結(jié)果表明，準(zhǔn)確度良好，符合定量測定的要求，見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果

2.4.11 樣品測定 按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按擬訂方法測定不同批次連翹子中連翹酯苷A，結(jié)果見表3。

表3 不同批次連翹子中連翹酯苷A測定結(jié)果

3 討論

連翹心被收錄于《上海市中藥炮制規(guī)范》(1994年版)中。目前連翹子尚未被收錄于《中國藥典》，連翹子藥材中有效成分檢測指標(biāo)的缺失嚴(yán)重影響其藥材質(zhì)量，建立連翹子中成分的定性定量的檢查方法對于保證連翹子藥材的質(zhì)量具有重要意義。

本實(shí)驗采用連翹酯苷A為對照品，建立了其薄層色譜檢識方法和高效液相色譜定量測定方法。連翹子揮發(fā)油及連翹酯苷A是連翹子中有效成分[ 2-3]，本實(shí)驗對所采購的10批連翹子揮發(fā)油含有量進(jìn)行了檢測，約在3%～5%之間，連翹酯苷A含有量在2%～4%。

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