HPLC法同時(shí)測定復(fù)方甘草片中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸

趙月然， 盧 丹

(大連市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 大連 116021)

復(fù)方甘草片[1]是臨床應(yīng)用較廣的祛痰鎮(zhèn)咳藥，療效確切且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。其以甘草浸膏為主藥，甘草浸膏可以覆蓋在發(fā)炎咽喉黏膜上， 掩蓋局部感覺神經(jīng)末梢， 從而減少刺激，發(fā)揮止咳效應(yīng)[2-3]。甘草據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4-11]，甘草具有潤肺，解毒，調(diào)和諸藥的作用。甘草中的甘草酸和甘草黃酮是生物活性較強(qiáng)的物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明甘草酸為皂苷類，在甘草中含有量較高，超過2%，其具有較強(qiáng)的保肝活性和腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，可增強(qiáng)內(nèi)耳聽覺，能夠抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、解毒止咳、抗腫瘤、影響脂質(zhì)代謝等作用。甘草中的甘草苷、異甘草苷、甘草素是甘草中重要的黃酮類化合物，具有抗?jié)?、抗菌、抗炎、解痙、鎮(zhèn)痛等作用。

《中國藥典》2010年版二部收載了復(fù)方甘草片中甘草酸定量測定，劉曉娜等[12]測定了復(fù)方甘草片中甘草酸、異甘草苷和異甘草素的量，楊紅娟等[13]同時(shí)測定了復(fù)方甘草片中嗎啡、磷酸可待因、甘草苷和甘草酸的量。本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取及高效液相色譜法同時(shí)測定復(fù)方甘草片中甘草酸、甘草苷、甘草素及異甘草苷的量，該方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為復(fù)方甘草片的質(zhì)量控制提供了有益的參考意見。

1 儀器與試藥

Agilent-1260型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、DAD檢測器；AS3120A超聲提取器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；BP211D型、BP221S型電子分析天平(德國Sartorius公司)。

甘草苷對照品(批號111610-200604)，甘草酸單銨鹽對照品(批號110731-200614,98%)均購于中國藥品生物制品檢定所；甘草素對照品(批號20100603)購于天津一方科技有限公司；異甘草苷對照品(批號20101108)購于上海永恒生物科技有限公司。復(fù)方甘草片3批(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司;批號 110911、111012、111113)。乙腈、甲醇為色譜純(美國MREDA公司)，

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Dikma Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脫(0～10 min，15%～25% A；10～20 min，25%～32% A；20～24 min，32%～34% A；24～30 min，34%～36% A；30～32 min，36%～42% A； 32～43 min，42%～51% A)；檢測波長為276 nm(0～16 min)、360 nm(16～24 min)、276 nm(24～28 min)、254 nm(28～38 min)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.甘草苷 2.異甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸對照品適量，分別加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為1.084 0 mg/mL、0.198 1 mg/mL、0.100 0 mg/mL、1.714 mg/mL的對照品貯備液，備用。分別加甲醇溶解，制成每1 mL分別含甘草苷54.20 μg、異甘草苷9.90 μg、甘草素10.00 μg、甘草酸171.4 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取復(fù)方甘草片20片，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL(含1%氨水)，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇(含1%氨水)補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸回歸方程

2.5 精密度試驗(yàn) 取復(fù)方甘草片粉末約0.5 g，精密稱定。按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的RSD值分別為1.6%、2.0%、2.2%、2.6%。結(jié)果表明,儀器精密度較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方甘草片粉末6份，每份粉末約0.5 g，精密稱定。按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測得甘草苷平均含有量為3.53 mg/g(RSD=1.1%)、異甘草苷平均含有量為1.56 mg/g(RSD=2.4%)、甘草素平均含有量為0.38 mg/g(RSD=2.9%)、甘草酸平均含有量為8.37 mg/g(RSD=1.2%)。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測定峰面積。甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸峰面積的RSD分別為1.3%、1.6%、1.9%、1.7%。結(jié)果表明，4種化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含有量的復(fù)方甘草片(111012)6份(甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的量分別為3.53、1.56、0.38、8.37 mg/g)，每份約0.25 g，精密稱定。分別準(zhǔn)確加入甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸對照品貯備液0.80、2.00、1.00、1.20 mL。按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2～5。

表2 甘草苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 異甘草苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4 甘草素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表5 甘草酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 取復(fù)方甘草片粉末3批，按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定并計(jì)算樣品中4種成分的量，結(jié)果見表6。

表6 樣品測定結(jié)果(n=3)

3 討論

依據(jù)文獻(xiàn)[14-17]，本實(shí)驗(yàn)分別考查了乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液四個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果表明采用乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相所得到的色譜圖4種化合物的分離效果好，干擾較小。故選用乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相系統(tǒng)。

提取條件分別考察了超聲、回流，結(jié)果表明，超聲30 min提取效果最好。提取溶劑分別考察了50%甲醇、70%乙醇和氨性乙醇，結(jié)果表明，氨性乙醇提取4個(gè)化合物的效果最好。

本實(shí)驗(yàn)建立的 HPLC法可以同時(shí)測定復(fù)方甘草片中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的量，此法專屬性好，靈敏度高，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于復(fù)方甘草片中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸的質(zhì)量控制,可作為質(zhì)量控制的定量方法。

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