正交實驗優(yōu)化微波輔助提取忍冬藤中綠原酸和咖啡酸工藝研究

李 克， 吳龍琴， 湯 淏， 王曙東

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院， 江蘇 南京 210002)

忍冬藤LoniceraeJaponicaeCaulis系常用中藥，含有多種有機酸。其中咖啡酸、綠原酸具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒以及抗氧化等多種藥理活性[1-4]，是評價忍冬藤藥材質(zhì)量的主要有效成分指標。

傳統(tǒng)的忍冬藤有效成分提取工藝多為水煎法，該工藝的不足在于提取時間過長、耗能較大。微波輔助萃取(Microwave Assisted Extraction，MAE)，又稱微波萃取(Microwave Extraction，ME)是微波和傳統(tǒng)的溶劑萃取法相結(jié)合而成的一種萃取方法。自1986年首先提出后[5]，因其具有設(shè)備要求較低、操作方便、提取效率高、能耗小以及成本低等特點，在中草藥有效組分提取領(lǐng)域呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，成為一種有發(fā)展?jié)摿Φ奶崛⌒鹿に嘯6-11]。本實驗采用高效液相色譜法檢測，以忍冬藤中有效成分綠原酸、咖啡酸為考察指標進行正交試驗，優(yōu)化并選定了忍冬藤藥材的微波輔助萃取提取工藝，并與超聲提取法以及水提醇沉法等工藝進行了比較。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀系統(tǒng)由二極管陣列檢測器、自動進樣器、 二元高壓泵及色譜工作站組成(Waters公司)；EM-309EBI微波加熱裝置(南京三樂微波技術(shù)發(fā)展有限公司)。冷凝回流提取裝置、真空泵、WH-3旋渦混合器(上海滬西儀器廠)。

綠原酸、咖啡酸對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，95 %乙醇為工業(yè)級，其他試劑均為分析純。實驗用水使用超純凈水。微孔濾膜購自南京中東化玻儀器公司。

忍冬藤供試藥材購自南京藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)地為我國山東。經(jīng)鑒定為忍冬科植物忍冬的干燥莖枝。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 準確稱取綠原酸、咖啡酸對照品各10 mg，以50%甲醇溶解后，分別移至10 mL量瓶中定容至刻度，搖勻，置4 ℃冰箱避光保存，即為對照品貯備液。工作液以貯備液稀釋配制。

2.2 樣品提取及制備

2.2.1 超聲提取法[12]精密稱取經(jīng)干燥粉碎忍冬藤粉末(過10目篩)約1 g，置25 mL的量瓶中，加50%甲醇定容，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放置冷卻至室溫。再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，按照色譜條件進樣測定。

2.2.2 水提醇沉法 按文獻[13]稱取經(jīng)粉碎、干燥藥材于圓底燒瓶中，加水煎煮提取3次。合并藥液，靜置，冷卻，過濾。取濾液加95%乙醇醇沉，過濾。取續(xù)濾液，經(jīng)微孔濾膜過濾后進樣測定。

2.2.3 微波輔助萃取法 按制定工藝條件，精確稱取經(jīng)粉碎(過10目篩)、干燥忍冬藤藥材約10 g進行提取。合并藥液，冷卻后過濾。取濾液加體積分數(shù)為95%乙醇(1∶2)醇沉40 min，過濾。取續(xù)濾液，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后進樣測定。

2.3 綠原酸、咖啡酸測定 按文獻[14]以HPLC法測定忍冬藤中綠原酸、咖啡酸的量。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗 分別考察了微波功率和提取時間兩個單一因素對忍冬藤藥材微波輔助提取工藝的影響，以確定正交試驗的適宜選擇范圍。

3.1.1 微波功率對提取得率的影響 平行稱取忍冬藤粉末3組，每組各4份，每份各約10 g，固定萃取條件為20倍水，提取2次，每次3 min，分別考察功率為400、500、600、700 W時對提取效果的影響。圖1結(jié)果顯示，隨著功率的增大，綠原酸、咖啡酸提取得率呈增加趨勢，當功率達到700 W時，綠原酸和咖啡酸得率達到最大。由于實驗設(shè)備條件所限，其最大功率只能700 W，若繼續(xù)增加功率，兩者得率可能還會增加。

圖1 微波功率對提取得率的影響(n=3)

3.1.2 提取時間對提取得率的影響 平行稱取忍冬藤粉末3組，每組各6份，每份各約10 g，固定萃取條件為功率600 W，20倍水，提取2次，每次提取時間分別為1、2、3、4、5、7 min，考察不同提取時間對提取效果的影響。由圖2結(jié)果可知，在提取時間為4 min之前提取量隨時間的增加而提高，4 min之后繼續(xù)增加提取時間對提取含量的影響不大。

圖2 提取時間對提取得率的影響(n=3)

3.2 微波提取工藝正交試驗

3.2.1 因素與水平確定 基于上述單因素試驗結(jié)果，試驗確定以微波功率、提取液與藥材液固比、提取時間以及提取次數(shù)4個對忍冬藤微波提取工藝影響較大的因素作為考察對象，以綠原酸和咖啡酸提取得率為考察指標，進行L9(34)正交試驗，因素與水平見表1。

表1 因素與水平

3.2.2 正交試驗及方差分析 制備9份樣品，分別按表1正交試驗設(shè)計進行微波提取。以綠原酸和咖啡酸提取量為考察指標進行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表2～表4。

從表2結(jié)果直觀分析，各因素對綠原酸和咖啡酸影響順序為D>C>B>A，以功率為誤差所在列進行方差分析，得出C、D因素差異有統(tǒng)計學(xué)意義。最佳工藝應(yīng)為A2B3C2D3，即功率600 W，24倍水，微波提取3次，每次4 min。參考微波功率對提取效果的單因素影響，實驗選定最佳工藝為A3B3C2D3，即功率700 W，24倍水，微波提取3次，每次4 min。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 綠原酸方差分析

表4 咖啡酸方差分析

3.3 不同提取工藝比較及驗證 實驗選定最佳工藝條件未包括在正交設(shè)計表的9次試驗中，因此對A3B3C2D3優(yōu)選條件進行驗證試驗，并與“2.2樣品提取及制備”項文獻報道所優(yōu)選出的水提醇沉法工藝及超聲提取工藝進行比較。結(jié)果見表5。

表5 不同提取方法提取忍冬藤中綠原酸和咖啡酸結(jié)果比較(n=3)

結(jié)果顯示，正交優(yōu)化后的微波輔助提取工藝和水提醇沉工藝對忍冬藤中綠原酸和咖啡酸提取率相近，且均明顯高于超聲提取法。但相比之下，微波輔助提取工藝可大大縮短提取時間，有效提高提取效率。具有明顯的快速、簡便、低耗、環(huán)保等優(yōu)勢。同時，微波輔助提取工藝可有效地克服傳統(tǒng)煎煮提取方法中藥材細粉易出現(xiàn)糊化、堵塞等問題，適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)[15]。

參考文獻：

[1] 齊樂輝, 楊連榮, 尹 蕊, 等. 忍冬藤成分分析及在抗菌消炎等方面的研究進展[J]. 黑龍江科技信息, 2010, (3): 207.

[2] Sato Y, Itagaki S, Kurokawa T,etal.Invitroandinvivoantioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid[J].IntJPharm, 2011, 403(1-2): 136-138.

[3] 李瑞國, 王彩君. 忍冬不同器官綠原酸提取及抑菌作用[J].時珍國醫(yī)國藥, 2012, 23(5): 1196-1197.

[4] 魯思愛. 忍冬藤的化學(xué)成分及其藥理應(yīng)用研究進展[J]. 臨沂大學(xué)學(xué)報, 2012, 34(3): 132-134.

[5] Ganzler K, Salgó A, Valkó K. Microwave extraction. A novel sample preparation method for chromatography[J].JChromatogr1986, 371: 299-306.

[6] 史高峰，李 娜，陳學(xué)福，等. 微波輔助提取枸杞中總多糖的工藝研究[J]. 中成藥, 2011, 33(3): 521-524.

[7] 謝 靜，周文富，張茶妹. 微波輔助法提取馬尾松樹皮總黃酮的研究[J]. 化學(xué)與生物工程, 2013, 30(1): 31-39.

[8] 王秀文，王穎莉，裴曉麗，等. 均勻設(shè)計法優(yōu)選黨參茯苓水溶性多糖的微波提取工藝[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012, 18(4): 24-27.

[9] 彭拓華，鐘世順，張少俊, 等. 三種提取方法提取洋金花生物堿的比較研究[J]. 中成藥，2012， 34(5): 832-835.

[10] 龔 磊，黃小容，龔其海，等. 微波輔助提取瑞香狼毒總黃酮工藝條件的優(yōu)化[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013, 48(2): 242-245.

[11] 劉學(xué)仁，蔡品品，姜 濤，等. 微波輔助提取枳殼中柚皮苷、新橙皮苷的工藝研究[J]. 中成藥, 2013, 35(2): 420-423.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 179.

[13] 李 克，王曙東，吳龍琴，等. 多因素正交試驗法優(yōu)化忍冬藤提取工藝研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐，2013, 27(2): 39-41.

[14] 李 克，吳龍琴，湯 淏，等. RP-HPLC法同時測定忍冬藤中綠原酸和咖啡酸含量[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐，2013, 27(1): 17-19.

[15] 歐陽麗娜, 李蘭林, 吳 雪, 等. 正交設(shè)計優(yōu)選竹節(jié)參總皂苷微波提取工藝的研究[J]. 中草藥, 2010, 41(10): 1639-1642.