HPLC法同時測定白喉烏頭中高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿

王 偉， 趙翡翠， 陳 良， 聶繼紅*

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830000)

白喉烏頭為毛茛科植物白喉烏頭AconitumleucostomumWorosch的干燥根，主產(chǎn)于我國新疆地區(qū)，在治療風(fēng)濕類疾病方面有獨特療效[1]。據(jù)報道[2-3]，白喉烏頭中含有氫溴酸高烏甲素、喉烏堿及去乙酰刺烏頭堿等，其中高烏甲素氫溴酸鹽在我國作為非成癮性鎮(zhèn)痛藥生產(chǎn)，而其在白喉烏頭中含有量很高，約占總生物堿量的40%，但未見有采用HPLC法測定白喉烏頭藥材中氫溴酸高烏甲素量的相關(guān)報道，同時白喉烏頭為烏頭屬植物，應(yīng)含有烏頭屬植物常見的雙酯型生物堿，其可能是白喉烏頭中的藥效成分和毒性成分[4]，有必要對白喉烏頭中生物堿成分和含有量進行研究分析。因此本實驗采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定白喉烏頭中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿，為白喉烏頭植物資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Direct-QTM5超純水儀(Millipore公司)，SK3300LH超聲清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，SI-234電子天平(北京丹佛儀器有限公司)，AG-135電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，XBridge-C18色譜柱。

1.2 試藥 白喉烏頭樣品(2013年采自新疆尼勒克地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部李永和主任中藥師鑒定為毛茛科植物白喉烏頭AconitumleucostomumWorosch的干燥塊根)；高烏甲素對照品(北京世紀(jì)奧科生技術(shù)有限公司，批號97792-45-5)；烏頭堿對照品(中國科學(xué)院成都生物研究所，批號MUST-13012802)；新烏頭堿對照品(中國科學(xué)院成都生物研究所，批號MUST-13012207)；氨水(分析純)；乙腈(色譜純)；無水乙醇(分析純)；鹽酸(分析純)；三氯甲烷(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 XBridgeTM-C18生物堿專用色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為 乙腈(B)-0.05%冰醋酸(三乙胺調(diào)pH為7.25)(D)梯度洗脫(洗脫程序見表1)；檢測波長 235 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。結(jié)果對照品和供試品色譜圖呈現(xiàn)良好的分離度，見圖1。

A．樣品 B．對照品1．氫溴酸高烏甲素 2．新烏頭堿 3．烏頭堿A．sample B．reference substance；1．hydrobromide lappaconitine 2．mesaconitine 3．a(chǎn)conitine

2.2 對照品溶液的制備 分別取氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿適量對照品并精密稱定,用色譜純乙腈定容配制成質(zhì)量濃度分別為4.075 mg/mL、2 mg/mL、2.05 mg/mL的混合對照品溶液,再依次梯度配制成6種不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液備用(見表2)。

表2 混合對照品質(zhì)量濃度

2.3 供試品溶液的制備 取白喉烏頭樣品粉末(過六號篩)約5 g并精密稱定，加入氨試液5 mL密閉浸潤后加入50 mL無水乙醇稱定質(zhì)量，超聲(23 ℃,53 kHZ)提取20 min后再次稱定質(zhì)量并用無水乙醇補足，過濾，濾液60 ℃以下?lián)]干；殘渣加20 mL1%HCl調(diào)pH 2左右,再加入氨水調(diào)pH 11左右，然后用三氯甲烷萃取3次(每次10 mL)，合并三氯甲烷層并60 ℃以下?lián)]干，殘渣加乙腈定容至5 mL量瓶，微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下不同質(zhì)量濃度混合對照品溶液按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積值，以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)進行線性回歸，得氫溴酸高烏甲素回歸方程y=8 271 176.586 3x-91 106.980 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2；烏頭堿回歸方程y=11 388 026.846 3x-409 124.842 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1；新烏頭堿回歸方程y=12 205 378.669 9x-83 826.586 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。表明氫溴酸高烏甲素進樣質(zhì)量濃度在0.081 5～8.150 0 mg/mL、烏頭堿進樣質(zhì)量濃度在0.040 0～4.000 0 mg/mL、新烏頭堿進樣質(zhì)量濃度在0.041 0～4.100 0 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗 取混合對照品溶液按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算3種化合物的含有量的RSD分別為2.24%、1.56%、2.25%，結(jié)果顯示儀器精密度較高。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取白喉烏頭藥材6份 按“2.3”項下制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進樣，測定氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿的峰面積，計算氫溴酸高烏甲素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.753 5 mg/g， RSD為2.06%(n=6)；烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.068 6 mg/g，RSD為1.16%(n=6)； 新烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.371 3 mg/g，RSD為2.57%(n=6)，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一白喉烏頭藥材約5 g，精密稱定，按“2.3”項下制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、4、8、14、20、24 h進樣10 μL，記錄色譜峰面積，計算氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為 2.77%、1.61%、2.08%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 取白喉烏頭藥材粉末約5 g精密稱定，按“2.3”項下制成供試品溶液，分別加入3種不同質(zhì)量濃度的氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿混合對照品，以“2.1”項下色譜條件進樣測定.計算加樣回收率，結(jié)果見表3～5。

表3 氫溴酸高烏甲素加樣回收率測定結(jié)果

2.4.6 樣品測定 取白喉烏頭藥材3份(5.002 0 g、5.003 8 g、5.002 3 g)，按“2.1”項下色譜條件平行測定3次，根據(jù)色譜峰面積計算出白喉烏頭藥材中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿、新烏頭堿的量，結(jié)果見表6。

表4 烏頭堿加樣回收率測定結(jié)果

表5 新烏頭堿加樣回收率測定結(jié)果

表6 樣品測定結(jié)果(n=3)

3 討論

本研究采用高效液相色譜法梯度洗脫同時測定了白喉烏頭中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿和新烏頭堿的量，但氫溴酸高烏甲素作為一種二萜類生物堿非常不穩(wěn)定，對光和高溫都較敏感，本實驗在供試品前處理過程中采取避光、60 ℃以下?lián)]干等方法，防止其降解。

本實驗在供試品前處理提取溶劑的選擇過程中，參照文獻[5-9]方法，分別篩選了甲醇、乙醇(75%,85%,95%,無水乙醇)、鹽酸(1%,0.5%)、水、氨水乙醚液(75%,85%,95%)、氨水、三氯甲烷等不同溶劑，最后根據(jù)色譜圖的分離度和峰形，最終選擇無水乙醇作為提取溶劑；同時考察供試品的提取方式(索式提取、連續(xù)回流提取、超聲提取等)，最終選擇超聲提取20 min為供試品提取方法。

本實驗采用二極管陣列檢測器多波長掃描，當(dāng)波長為235 nm時高烏甲素和烏頭堿、新烏頭堿均能被檢出并且吸收較好，故確定其為檢測波長；同時考慮到白喉烏頭中活性成分的極性差異[10]，因此針對梯度洗脫系統(tǒng)做了大量的考察和對比，包括甲醇-水，乙腈-水，甲醇-三氯甲烷-水，乙腈-乙酸氨等系統(tǒng)，經(jīng)比較和分析不同洗脫系統(tǒng)下的色譜圖分離度和峰形，表明乙腈-乙酸氨系統(tǒng)分離效果較好，故確定其為流動相體系進行梯度洗脫，并對流動相的比例做了大量工作，確定在流動相中加入二乙胺可以改善色譜峰拖尾現(xiàn)象[11]。

本實驗中高效液相色譜圖中各成分色譜峰清晰，分離度較好，穩(wěn)定性和精密度等方法學(xué)考察均符合要求，表明采用高效液相色譜法梯度洗脫同時測定了白喉烏頭中氫溴酸高烏甲素、烏頭堿和新烏頭堿的量，方法可行，操作簡便，可用于白喉烏頭中活性成分的測定和質(zhì)量控制，也為白喉烏頭的資源利用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂奠定了基礎(chǔ)。

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