GC法測(cè)定復(fù)方麝香注射液中6種揮發(fā)性成分

劉明穎， 謝媛媛， 劉軍鋒， 梁瓊麟， 王義明， 羅國(guó)安*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004；2.清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084；3.神威科技醫(yī)藥股份有限公司，河北 石家莊 051430)

復(fù)方麝香注射液由人工麝香、廣藿香、石菖蒲、郁金、冰片和薄荷腦制成，具有芳香走串、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、醒神除乏、鎮(zhèn)靜安神和鎮(zhèn)痛止痙等功效[1]。臨床可用于改善神經(jīng)功能損傷[2]，抗炎退熱[3]和鎮(zhèn)痛[4]等。原料藥人工麝香主要成分麝香酮具有心肌細(xì)胞[5]保護(hù)作用，冰片主要成分異龍腦和龍腦具有提高血腦屏障通透性[6]和雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)[7]的作用，薄荷腦具有促滲[8]和解痙[9]作用。組方藥材均含有大量的揮發(fā)性成分，其中廣藿香主要成分百秋里醇具有抗抑郁[10]和抗炎作用[11-12]，石菖蒲主要成分細(xì)辛腦具有抗細(xì)胞凋亡[13]和減輕自噬現(xiàn)象[14]的作用，郁金具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃的功效[15]。目前復(fù)方麝香注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10356(ZD-0356)-2002，僅通過(guò)薄層色譜進(jìn)行控制，本實(shí)驗(yàn)建立了復(fù)方麝香注射液中6種主要成分異龍腦、龍腦、L-薄荷醇、α-細(xì)辛腦、百秋李醇和麝香酮的定量測(cè)定方法，為復(fù)方麝香注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Varian 3800氣相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，配有FID檢測(cè)器，STAR 50C工作站)；Mikro 22R離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑 乙酸乙酯、正己烷(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；二氯甲烷、石油醚、環(huán)己烷、丙酮、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，超純水(自制)。

1.3 對(duì)照品 龍腦、異龍腦、薄荷腦、百秋李醇、麝香酮(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%，批號(hào)分別為110881-201107、111512-200201、110728-200506、110772-201206、110719-201215)，α-細(xì)辛腦(購(gòu)自美國(guó)sigma公司，批號(hào)為101104448)

1.4 樣品 8批復(fù)方麝香注射液，由生產(chǎn)企業(yè)提供。

2 方法

2.1 氣相色譜條件 VF-5 ms氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，體積流量1.0 mL/min，分流比為10∶1；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測(cè)器溫度280 ℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，以4 ℃/min升溫至100 ℃，保持10 min,以10 ℃/min升溫至140 ℃,再以3 ℃/min升溫至195 ℃,再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持10 min。得到復(fù)方麝香注射液GC色譜圖，如圖1。

1.異龍腦 2.龍腦 3.L-薄荷醇 4.α-細(xì)辛腦 5.百秋李醇 6.麝香酮 IS.水楊酸甲酯1.isoborneol 2.borneol 3.L-menthol 4.alpha-asarone 5.patchouli alcohol 6.muscone IS.methyl salicylate

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取水楊酸甲酯適量，精密稱(chēng)定，用正己烷溶解并稀釋成3.32 mg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品異龍腦8.41 mg，龍腦2.84 mg，L-薄荷醇5.17 mg，α-細(xì)辛腦0.25 mg，百秋李醇8.38 mg，麝香酮1.48 mg，精密稱(chēng)定，分別置于10 mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液的制備 取復(fù)方麝香注射液10 mL，置渦旋瓶中，精密加入正己烷10 mL，密塞，渦旋2 min，離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)，分取有機(jī)層于10 mL量瓶中，用正己烷定容，用微孔濾膜(0.45 μm有機(jī)膜)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 測(cè)定方法 分別取對(duì)照品和水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)混合溶液、復(fù)方麝香注射液供試品溶液，精密吸取1 μL注入氣相儀，測(cè)定，即得。

3 結(jié)果

3.1 色譜分離結(jié)果 按照上述氣相色譜法分別進(jìn)樣測(cè)定，見(jiàn)圖1。圖1中顯示各色譜峰分離度良好。

3.2 線性關(guān)系考察 以“2.3”項(xiàng)中對(duì)照品溶液為母液，取適量于5 mL量瓶中，加入“2.2”項(xiàng)中內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL，將對(duì)照品溶液濃度稀釋至母液濃度的0、0.8、1.0、5.0、10、100倍，加正己烷至刻度，搖勻，即得。按照上述色譜條件，分別精密吸取1 μL注入色譜儀中，測(cè)定6種成分峰面積，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比為縱坐標(biāo)，計(jì)算得到線性回歸方程，結(jié)果如表1。

表1 6種成分線性方程和線性范圍

3.3 精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為L(zhǎng)OT 1202942復(fù)方麝香注射液，按照“2.4”項(xiàng)方法，制備一份供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定6種成分的峰面積。結(jié)果表明異龍腦、龍腦、L-薄荷醇、α-細(xì)辛腦、百秋李醇和麝香酮的RSD分別為0.17%、0.18%、0.17%、4.0%、1.4%和1.4%，均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為L(zhǎng)OT 1202942復(fù)方麝香注射液，按照“2.4”項(xiàng)方法，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣，測(cè)定6種成分的峰面積。結(jié)果表明異龍腦、龍腦、L-薄荷醇、α-細(xì)辛腦、百秋李醇和麝香酮的RSD分別為3.0%、2.7%、3.5%、4.7%、3.8%和4.8%，均小于5.0%，表明方法的重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為L(zhǎng)OT 1202942復(fù)方麝香注射液，按照“2.4”項(xiàng)方法，制備一份供試品溶液，在上述色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定6種成分的峰面積。結(jié)果表明異龍腦、龍腦、L-薄荷醇、α-細(xì)辛腦、百秋李醇和麝香酮的RSD分別為0.19%、0.22%、0.27%、4.4%、0.40%和0.96%，均小于5.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含有量的復(fù)方麝香注射液(LOT 1202942)10 mL，分別精密加入高、中、低3個(gè)水平的對(duì)照品，每個(gè)水平3份，共9份，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，制備供試溶液并進(jìn)樣分析，結(jié)果異龍腦、龍腦、L-薄荷醇、α-細(xì)辛腦、百秋里醇和麝香酮的加樣回收率為96.7%～102.3%，RSD為1.3%～3.6%，表明該方法回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6個(gè)成分加樣回收率考察結(jié)果(n=3)

3.7 樣品測(cè)定 按照“2.4”項(xiàng)供試品溶液的制備方法，制備8批復(fù)方麝香注射液的供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算6種成分的量，結(jié)果如表3。

表3 復(fù)方麝香注射液中6種成分的測(cè)定結(jié)果(mg/mL)

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、石油醚、環(huán)己烷、丙酮等6種有機(jī)溶劑進(jìn)行考察，比較溶劑對(duì)復(fù)方麝香注射液各成分含有量的影響。結(jié)果正己烷提取率最高，因此選擇正己烷作為提取溶劑。

4.2 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)選擇水蒸氣蒸餾法和萃取法兩種提取方式進(jìn)行考察，得到萃取法與水蒸氣蒸餾法提取率相差不大，萃取法較水蒸氣蒸餾法操作簡(jiǎn)便、易于重復(fù)，因此選擇萃取法。

4.3 載氣體積流量的選擇 分別對(duì)不同載氣體積流量0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min進(jìn)行色譜分析，考察不同載氣體積流量對(duì)各色譜峰色譜行為的影響。載氣體積流量小于等于0.8 mL/min，或體積流量等于1.2 mL/min，異龍腦和龍腦無(wú)法完全分離，體積流量為1.0 mL/min時(shí)，各成分分離較好，因此選擇載氣體積流量為1.0 mL/min。

4.4 內(nèi)標(biāo)的選擇 分別對(duì)環(huán)己酮、異戊醇、苯乙酮、苯甲醇、水楊酸甲酯、正十四烷、正十一烷、正十五烷和正十八烷等9種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行考察，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物選擇的原則，考慮內(nèi)標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間，得到水楊酸甲酯作為復(fù)方麝香注射液中成分測(cè)定的內(nèi)標(biāo)較為合適。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了8批復(fù)方麝香注射液中6種主要化學(xué)成分，即冰片、薄荷腦、廣藿香、石菖蒲和人工麝香中指標(biāo)成分異龍腦、龍腦、L-薄荷醇、百秋里醇、α-細(xì)辛腦和麝香酮，能夠更加全面地對(duì)復(fù)方麝香注射液進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)為復(fù)方麝香注射液的臨床研究提供了基礎(chǔ)。

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