小檗堿在Caco-2細(xì)胞單層模型中吸收和外排機(jī)制的研究

陳健龍， 張玉玲， 董 宇， 蔡廣知， 貢濟(jì)宇*， 崔翰明*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

小檗堿又稱黃連素，是異喹啉生物堿，存在于小檗科等4個(gè)科10個(gè)屬的多種植物中[1]。在臨床上主要作為抗菌藥和清熱解毒藥，隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其還具有調(diào)脂、抗腫瘤、降血糖等多方面的藥理作用[2]，文獻(xiàn)報(bào)道[3]小檗堿口服吸收差，生物利用度較低，但其口服吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不明確。

Caco-2 細(xì)胞來源于人體結(jié)腸癌細(xì)胞，與人體同源性好；Caco-2(the humancolon carcinoma cell line)細(xì)胞模型是近十幾年來國外廣泛采用的一種藥物腸吸收的體外模型，與腸上皮近似，細(xì)胞內(nèi)有藥物代謝酶，Caco-2細(xì)胞模型用于研究藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)比較簡便[4-5], 本實(shí)驗(yàn)旨在利用Caco-2細(xì)胞模型研究小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，同時(shí)考察其是否為P-糖蛋白的底物，為含有小檗堿的中藥復(fù)方吸收機(jī)制研究提供參考。

1 儀器和材料

Waters H-class超高效液相色譜儀(四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)、PDA檢測器)；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；HZS-H恒溫水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；TranswellTM培養(yǎng)板(CorningCostar公司)；MSU225S-000-DU 1/100萬電子分析天平(德國塞多利股份公司)；MILLIPORE純水機(jī)(MILLIPORE公司，型號Q-POD)；HERAcell1501-CO2恒溫孵育箱(美國Thermo Forma公司)；DI-CJ-2ND-超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；eclipse Ti-U-倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)；CF16RX-Ⅱ-離心機(jī)(日本Hitachi公司)。

Caco-2細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；鹽酸小檗堿對照品(批號110713-200609 購自中國食品藥品檢定研究院)；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清均購自于Gibco公司；非必須氨基酸購自于sigma公司；熒光素鈉(sigma公司，批號101170902)；普萘洛爾(sigma公司，批號101143426)；維拉帕米(sigma公司，批號1001211726)，乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析級。

2 方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)，流動(dòng)相乙腈-水(2 mmoL乙酸銨和0.05%甲酸，pH為3.20)=30∶70，體積流量為0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長345 nm。

2.2 小檗堿、工具藥和抑制劑溶液的配制 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，置于10 mL量瓶中，用Hanks溶液定容至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為201.6 μg/mL的小檗堿對照品貯備液。

精密稱取普萘洛爾和熒光黃對照品適量，分別置于100 mL量瓶中，用Hanks溶液定容至刻度，搖勻，得普萘洛爾和熒光黃對照品貯備液分別為30.04 μg/mL和20.08 μg/mL。

精密稱取維拉帕米對照品適量，置于10 mL量瓶中，用Hanks溶液(含小檗堿30 μmol/L)定容至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為45.46 μg/mL的維拉帕米對照品貯備液。

2.3 Caco-2細(xì)胞單層模型的建立 Caco-2細(xì)胞在37 ℃,含5% CO2,相對濕度為90%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中含10%FBS、1%非必需氨基酸、和1%青-鏈霉素。將細(xì)胞按50 000個(gè)/cm2接種到6孔Transwell培養(yǎng)板上,培養(yǎng)21d[6-7]。經(jīng)過驗(yàn)證，細(xì)胞形成緊密的單層后即可用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 線性關(guān)系 分別精密吸取一定量小檗堿對照品貯備液，用Hanks溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、500 ng/mL的系列對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

2.5 精密度、穩(wěn)定性和回收率試驗(yàn)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 分別取線性范圍內(nèi)高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定6次，連續(xù)測定3 d，記錄峰面積，計(jì)算分別日內(nèi)和日間的精密度。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取中濃度對照品溶液，分別于1、2、3、4、5、6 d按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算小檗堿質(zhì)量濃度的RSD。

2.5.3 回收率試驗(yàn) 精密吸取一定量小檗堿對照品貯備液，用Hanks溶液稀釋定容，使小檗堿終質(zhì)量濃度為150 ng/mL，重復(fù)試驗(yàn)6次。然后按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，計(jì)算小檗堿的回收率。

2.6 檢測限和定量限 分別取質(zhì)量濃度為5和15 ng/mL的小檗堿溶液進(jìn)樣，根據(jù)S/N3和S/N10計(jì)算最低檢測限和最低定量限。

2.7 方法專屬性試驗(yàn) 以Hanks溶液作為空白樣品，然后按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定；將一定濃度的小檗堿溶液加到空白樣品中，依同法操作，分別得色譜圖1中A和B。

圖1 小檗堿的超高液相色譜圖

2.8 Caco-2細(xì)胞單層模型的驗(yàn)證 按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[8]，進(jìn)行在 Caco-2 細(xì)胞單層模型上呈良好吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的陽性對照藥普萘洛爾和難吸收轉(zhuǎn)運(yùn)陽性對照藥熒光黃的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。接種的 Caco-2細(xì)胞，在培養(yǎng)的第21天，在AP側(cè)加入質(zhì)量濃度為30 μg/mL普萘洛爾或質(zhì)量濃度為20 μg/mL熒光黃溶液0.5 mL，BL側(cè)加入空白Hank溶液1.5 mL，置于37 ℃水浴中，在60 min取BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)液適量進(jìn)行測定。熒光黃完全不被吸收，Papp應(yīng)在5×10-7cm/s，檢測膜的完整性。普萘洛爾易于吸收，Papp應(yīng)在1×10-5cm/s，檢測膜的單層性,同時(shí)測定細(xì)胞電阻值快速檢測細(xì)胞完整性和單層性。

2.9 小檗堿雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 待TranswelTM培養(yǎng)板長到21 d時(shí)，測定細(xì)胞的電阻，選擇電阻大于350 Ω的用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。用預(yù)熱至37 ℃的Hanks溶液洗細(xì)胞兩次，最后一次放置在37 ℃培養(yǎng)箱中30 min后吸棄，然后將不同質(zhì)量濃度的小檗堿溶液加在AP側(cè)或BL側(cè)為供給池，同時(shí)對應(yīng)的BL側(cè)或AP側(cè)加空白的Hanks溶液，將TranswellTM培養(yǎng)板放在37 ℃，50 r/min的水浴鍋中，分別在30、60、90、120 min吸取0.1 mL或0.2 mL的接受液，同時(shí)補(bǔ)加等體積空白的Hanks溶液，每組平行3個(gè)復(fù)孔，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定。

2.10 P-gp抑制劑維拉帕米對小檗堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 Caco-2細(xì)胞在TranswellTM板中培養(yǎng)21 d后,測定細(xì)胞的電阻，選擇電阻大于350 Ω的用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。在AP側(cè)加入30 μmol/L小檗堿,其中一組含10 μmol/L維拉帕米,對照組不加維拉帕米,每組平行3份。置于轉(zhuǎn)速為50 r/min 37 ℃水浴恒溫振蕩器,分別在30、60、90、120 min吸取BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)液0.2 mL。在BL側(cè)進(jìn)行相同操作收集AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)液,按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定。

2.11 數(shù)據(jù)分析 Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表觀滲透系數(shù)的計(jì)數(shù)：

Papp=(dQ/dt)/AC

其中dQ/dt為接受藥物側(cè)待側(cè)藥物出現(xiàn)的速率(μg/min)，A為細(xì)胞單層表面積(cm2)，C為給藥側(cè)的初始藥物質(zhì)量濃度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)研究結(jié)果 在本研究應(yīng)用的分析條件下,Hanks液中的其他物質(zhì)不干擾小檗堿的測定。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得小檗堿回歸方程為：Y=73.991X-126.622 (r=0.999 4)，線性范圍：18.3～458 ng/mL；方法的高、中、低質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度分別為(1.71%、2.19%、5.33%)，日間精密度分別為(4.77%、6.92%、8.58%)，24 h穩(wěn)定性的RSD分別為4.04%，均小于10%，回收率在96.94%～100.99%之間,見表1。定量限(S/N3)和檢測限(S/N10)分別為5.058 7和16.862 4 ng/mL。所建方法能滿足Caco-2細(xì)胞單層模型中Hanks液中小檗堿檢測的需要。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.2 工具藥(普萘洛爾和熒光黃)在Caco-2細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn) 實(shí)驗(yàn)條件下,采用陽性藥物普萘洛爾和陰性藥物熒光黃鑒定Caco-2細(xì)胞單分子膜形成，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在TranswellTM培養(yǎng)21d后，得到陽性對照藥普萘洛爾的Papp值為1.29×10-5cm/s,符合文獻(xiàn)報(bào)道值2.75×10-5cm/s[9]，陰性藥熒光黃的Papp值為5.17×10-7cm/s,符合文獻(xiàn)報(bào)道值5×10-7cm/s[10]，說明Caco-2細(xì)胞單分子膜形成，并在此時(shí)測量細(xì)胞膜的電阻，在之后的實(shí)驗(yàn)中用此電阻值來判斷細(xì)胞是否形成單分子層。

3.3 小檗堿在Caco-2細(xì)胞單層模型轉(zhuǎn)運(yùn)研究 生長在對數(shù)期的Caco-2細(xì)胞接種在TranswellTM培養(yǎng)板上，培養(yǎng)21 d，細(xì)胞的電阻350 Ω 可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究。不同質(zhì)量濃度小檗堿AP-BL、BL-AP累積透過量與時(shí)間的關(guān)系，見圖2。在小檗堿不同質(zhì)量濃度的情況下，其BL-AP的Papp大于AP-BL的Papp，且比值大于1.5，小檗堿可能是P-gp糖蛋白的底物。

3.4 P-gp抑制劑維拉帕米對小檗堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 維拉帕米的加入量參考文獻(xiàn)[11]。加入P-gp抑制劑維拉帕米后對小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)量及Papp與對照組有所不同，結(jié)果見表3，圖3。加入抑制劑后小檗堿的表觀滲透系數(shù)明顯增加(P<0.05)，降低小檗堿的外排，進(jìn)一步證明小檗堿受到P-糖蛋白的外排作用。

1.BL-AP轉(zhuǎn)運(yùn)曲線 2.AP-BL為轉(zhuǎn)運(yùn)曲線 1.Transport of basolateral to apical 2.Transport of apical to basolateral

表3 小檗堿與加入維拉帕米的表觀滲透系數(shù)

圖3 小檗堿與加入維拉帕米的表觀滲透系數(shù)

4 討論

Caco-2細(xì)胞來源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞，具有與小腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和緊密連接，可以模仿小腸上皮吸收；該模型操作簡便、重復(fù)性較好，實(shí)驗(yàn)條件比較容易控制，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相比，培養(yǎng)細(xì)胞要比培養(yǎng)動(dòng)物更省時(shí)、更經(jīng)濟(jì)，是目前較理想的體外吸收模型，是闡明藥物吸收機(jī)制的有力工具[12]，本實(shí)驗(yàn)建立的測定Hanks溶液中小檗堿的反相超高液相色譜方法，經(jīng)專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、穩(wěn)定性及回收率等方法學(xué)驗(yàn)證，表明此分析方法具有靈敏、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，所建方法能滿足Caco-2細(xì)胞單層模型中Hanks液中小檗堿檢測的需要。

在新藥研究和開發(fā)過程中藥物外排泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用也已成為促進(jìn)藥物吸收和提高生物利用度的研究熱點(diǎn)。由于不同種類藥物外排泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腸道上皮細(xì)胞存在于不同的位置，導(dǎo)致其功能作用也不同。因此可以利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)特性，對藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，通過增加其與促吸收蛋白的親和力而促進(jìn)吸收。此外也可利用藥物外排泵底物結(jié)構(gòu)修飾、底物與外排泵抑制劑的聯(lián)合用藥等方式，提高口服藥物的生物利用度[13]。

P-糖蛋白是一種跨膜糖蛋白，具有能量依賴性“藥泵”功能。有資料報(bào)道，復(fù)發(fā)和難治的白血病患者其P-gp表達(dá)較正常人增加。當(dāng)藥物經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑吸收時(shí)，P-gp泵成為藥物吸收的一個(gè)重要生理屏障，它能減少細(xì)胞吸收藥物，因此成為口服生物利用度低、波動(dòng)大的一個(gè)重要影響因素[14]。

利用人小腸上皮Caco-2細(xì)胞單層來進(jìn)行藥物小腸吸收的細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種預(yù)測藥物在人體小腸吸收以及研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)篩選工具。Caco-2細(xì)胞在TranswellTM培養(yǎng)板上培養(yǎng)，自發(fā)的分化出AP側(cè)與BL側(cè)，在AP側(cè)有高表達(dá)的P-gp。在轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，4個(gè)不同質(zhì)量濃度的小檗堿溶液在轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)得到Papp沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明小檗堿的吸收以被動(dòng)擴(kuò)散為主。藥物從基地側(cè)到頂端通透性與從頂端到基底端通透性有顯著性差異。不同質(zhì)量濃度小檗堿其Papp(BL-AP)遠(yuǎn)大于Papp(AP-BL),其比值在8～10之間，說明小檗堿更易由基底面到腸腔面，可能有外排泵參與轉(zhuǎn)運(yùn)。P-gp是一種質(zhì)膜糖蛋白，是多藥耐藥基因mdr1的產(chǎn)物，存在Caco-2細(xì)胞中，其功能是將藥物由BL側(cè)藥物逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至AP側(cè)，使藥物的吸收降低。加入P-gp抑制劑維拉帕米后，小檗堿的Papp(AP→BL)明顯增加，Papp(BL→AP)降低，說明聯(lián)用維拉帕米降低了小檗堿的外排，而使小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)增加，更進(jìn)一步說明小檗堿是P-糖蛋白的底物。而外排的存在是導(dǎo)致小檗堿的口服吸收減少，口服生物利用度較低的原因。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lu T，Liang Y，Song J，etal.Simultaneous determination of berberine and palmatine in rat plasma by HPLC-ESI-MS after oral administration of traditional Chinese medicinal preparation Huang-Lian-Jie-Du decoction and the pharmacokinetic application of the method[J].JPharmBiomedAnal，2006，40(5):1218.

[2] Abourashed E A, Khan I A. High-performance liquid chromatography determination of hydrastine and berberine in dietary supplements containing goldenseal[J].JPharmSci，2001,90(7):817-822.

[3] Huang S H, Long X Y, Yuan F,etal. Correlativity between solubility O/W partition coefficients of berbenine hydrochloride and intestinal absorption in rats in situ[J].ChinJModApplPharm, 2012, 29(3): 233-238.

[4] Yang H T，Wang G J． Caco-2 cell monolayers model and its application in pharmacy[J].ActaPharmSin，2000，35(10): 797-800.

[5] Liao S，Xie J W． Application of Caco-2 cell model in druginvitroresearch[J]．ChinJNewDrugs，2005，14(4) : 416-419.

[6] Samii A, Etminan M, Wiens M O,etal. NSAID use and the risk of Parkinson′s disease: systematic review and meta-ana-lysis of observational studies[J].DrugsAging, 2009, 26(9):769-779.

[7] 宋 麗，張 寧，徐德生.芍藥苷在Caco-2細(xì)胞模型中吸收機(jī)制的研究[J].中草藥，2008,39(1):41-44.

[8] 楊秀偉，楊曉達(dá)，王 瑩，等.中藥化學(xué)成分腸吸收研究中Caco-2細(xì)胞模型和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程的建立[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007,5(6):634-641.

[9] Choi S Y,Ahn E M, Song M C,etal.InvitroGABA-transam-inase inhibitory compounds from the root of Angelica dahurica[J].PhytotherRes, 2005, 19(11):839-8451.

[10] 帕麗達(dá)·阿不力孜,叢媛媛,米仁沙·牙庫甫，等.Caco-2細(xì)胞體外吸收模型的建立及評估[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011,7(4):6-8.

[11] 葛月賓，馬 燕，李衛(wèi)中.大豆苷元在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[J].中草藥，2009,32(10):1563-1567.

[12] 楊秀偉，楊曉達(dá)，王 瑩，等.中藥化學(xué)成分腸吸收研究中Ca-co- 2 細(xì)胞模型和標(biāo)準(zhǔn)操作程序的建立[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007，5(6) : 634.

[13] 王 平，劉 輝，孟憲麗等.藥物外排泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對口服藥物吸收影響的研究進(jìn)展[J].中藥與臨床，2010,1(2):54-57.

[14] 王亞之, 歐喜笑, 鄭 穎.外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶與黃酮的相互作用及其對黃酮腸吸收影響的研究進(jìn)展[J].中草藥，2009，40(10):1659-1663.