生姜對(duì)小柴胡湯中柴胡皂苷a和黃芩苷腸道吸收的影響

蔣蘇貞， 黃小兵， 吳海秀， 陳春麗， 向云亞， 邱錦濤， 丘志堅(jiān)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

生姜為姜科姜屬植物姜ZingiberofficinaleRosc.的鮮根莖，是一種廣泛應(yīng)用的藥食兩用植物，生姜在仲景組方中占重要位置和比例[1]，而生姜對(duì)中藥復(fù)方配伍究竟有何影響作用，尤其從藥物與藥物相互作用、相互轉(zhuǎn)化或分解代謝，藥物在腸道吸收等角度來闡述，作者尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。小腸是大多數(shù)口服藥物主要的吸收部位, 預(yù)測藥物小腸吸收的方法主要有離體法和在體法。在體法中大鼠單向腸灌流法 (SPIP)因不損傷研究部位的循環(huán)系統(tǒng)和生理環(huán)境從而能夠較好地模擬人體的體內(nèi)環(huán)境，且結(jié)果與人體試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性良好[2-3]，目前在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。因此本課題采用大鼠在體單向腸灌流模型，以小柴胡湯中君藥和臣藥主要成分柴胡皂苷a和黃芩苷為指標(biāo)，探討配伍生姜對(duì)小柴胡湯水煎液中兩種成分在腸道吸收的差異，從藥物“配伍-吸收”角度闡述生姜對(duì)中藥復(fù)方配伍的影響作用及其機(jī)理，為臨床合理用姜提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SummitP680型高效液相色譜儀(美國DIONEX 公司)；Chromeleon色譜工作站(美國DIONEX公司)；UVD170U紫外檢測器；T6型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)； CU600型電熱恒溫水箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；蠕動(dòng)泵(天津協(xié)達(dá))；EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 藥品及試劑 柴胡、黃芩、黨參、清半夏、大棗、生姜、甘草均購自采芝林藥業(yè)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李薇教授鑒定為正品；柴胡皂苷a、黃芩苷(批號(hào)MUST-10090202，MUST-11052402)購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸，乙醚，正丁醇為分析純；甲醇，乙腈為色譜純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(210±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證：SCXKC(粵)2008-0020。

1.4 溶液配制

1.4.1 Krebs-Ringer(K-R)液的配制 NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、CaCl20.37 g、葡萄糖1.4 g，加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，即得。

1.4.2 小柴胡湯制備 含姜小柴胡湯：取柴胡32 g，黃芩12 g，清半夏12 g，黨參12 g，生姜12 g，甘草10 g，大棗10 g，以水煎煮3次，第1次加水1 000 mL煎煮1 h,第2、3次各加800 mL水，各煎煮45 min，合并煎液，濾過，濃縮成200 mL。不含姜小柴胡湯制備：小柴胡湯藥材中去除生姜，其它操作均同含姜小柴胡湯。

1.4.3 腸灌流液的配制 每100 g體質(zhì)量大鼠取小柴胡湯5 mL，用K-R 液定容至50 mL，作為腸灌流液。 空白腸灌流液制備：取K-R液適量，按“大鼠在體單向腸灌流”方法灌流，收集流出液，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)[4]

2.1.1 手術(shù)方法 實(shí)驗(yàn)前將大鼠禁食12 h(自由飲水), 腹腔注射20%烏拉坦。麻醉后, 將大鼠固定于恒溫手術(shù)臺(tái)上，沿腹中線切開長約3～4 cm的開口,選取約為10 cm回腸, 于切口的上下端插管，結(jié)扎固定, 將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕,用37 ℃的生理鹽水沖洗腸段內(nèi)容物至凈。換用預(yù)熱至37 ℃的臺(tái)氏液以1 mL/min體積流量灌流10 min，平衡管路及腸段后換上預(yù)熱至37 ℃的灌流液以0.2 mL/min體積流量灌流，30 min后，進(jìn)液口處用已知質(zhì)量的裝有灌流液的小瓶以同樣流速灌流，出液口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集流出液,每隔25 min迅速更換一次灌流液小瓶和收集液小瓶，放冷至室溫后，稱量供試液小瓶和收集液小瓶的質(zhì)量。分別取出0.5 mL后再分別稱量供試液小瓶和收集液小瓶的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)持續(xù)105 min后, 剪下灌流的腸段，測量腸段長度與直徑。

2.1.2 數(shù)據(jù)分析[5]實(shí)驗(yàn)中小腸不僅吸收藥物也吸收和分泌水分, 導(dǎo)致供試液體積變化, 故不能用直接測定藥物濃度的方法計(jì)算藥物的吸收。本實(shí)驗(yàn)采用重量法對(duì)灌流液的流入和流出的體積進(jìn)行校正,消除其體積變化的影響，按下列方程式計(jì)算藥物吸收速率常數(shù) (Ka)和表觀吸收系數(shù)(Papp):

Qin和Qout分別為腸道進(jìn)出口灌流液的體積(mL，假設(shè)進(jìn)出口灌流液的質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL)；L和r分別為被灌流腸段的長度(cm)和橫截面半徑(cm)；Q為灌流體積流量(約0.2 mL/min)，V為灌流腸段的體積(cm3)。

2.2 灌流液中柴胡皂苷a、黃芩苷的測定

2.2.1 色譜條件 DiamonsilC18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；柴胡皂苷a流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，0～5 min為30∶70，5～25 min為40∶60，25～30 min為30∶70，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，檢測波長210 nm。黃芩苷流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(55∶45∶0.2),體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL, 檢測波長280 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品2.03 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。精密稱取黃芩苷對(duì)照品2.40 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 柴胡皂苷a的制備[6]：取各時(shí)間段收集的腸灌流液各4 mL，加入水飽和正丁醇，萃取3次，每次2 mL，合并正丁醇液濃縮至干，溶于1.5 mL水中，用乙醚萃取3次，每次1.5 mL,棄去乙醚層，加入水飽和正丁醇，萃取3次，每次1.5 mL,合并正丁醇液濃縮至干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解并定容至1 mL，即得。黃芩苷的制備[7]：取各時(shí)間段收集的腸灌流液各30 μL，精密加入甲醇3 mL，11 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 分別取柴胡皂苷a和黃芩苷對(duì)照品溶液、供試品及空白腸灌流液依法測定；結(jié)果顯示，柴胡皂苷a和黃芩苷的保留時(shí)間分別為16.5 min 和8.2 min，兩者峰形均良好，無雜質(zhì)峰干擾，色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 腸灌流液中柴胡皂苷a對(duì)照品(A)、供試品(B)和空白腸灌流液(C)的HPLC圖

圖2 腸灌流液中黃芩苷對(duì)照品(A)、供試品 (B)和空白腸灌流液(C)的HPLC圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 取柴胡皂苷a對(duì)照品溶液適量，揮去甲醇，加入空白腸灌流液4 mL，配制成0.76、2.28、3.81、7.61、10.15、15.23 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液，按柴胡皂苷a供試品制備方法進(jìn)行制備，各質(zhì)量濃度進(jìn)樣20 μL，以質(zhì)量濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得柴胡皂苷a的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.110X-0.056 (r=0.999 5)，表明柴胡皂苷a在0.76～15.23 μg/mL線性關(guān)系良好。

取黃芩苷對(duì)照品適量，揮去甲醇，加入空白腸灌流液3 mL，配制成1.0、2.0、4.0、8.0、10.0和12.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液, 按黃芩苷供試品制備方法進(jìn)行制備，各質(zhì)量濃度進(jìn)樣10 μL，以質(zhì)量濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.448X-0.302(r=0.999 4)，表明黃芩苷在1.0～12.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.6 方法回收率試驗(yàn) 分別取5份柴胡皂苷a對(duì)照品溶液各0.1 mL，揮去甲醇，分別溶于4 mL大鼠空白腸灌流液，按柴胡皂苷a供試品制備方法進(jìn)行制備，測定,計(jì)算柴胡皂苷a的回收率；測得柴胡皂苷a的回收率97.56%，RSD為2.54%；

分別取5份黃芩苷對(duì)照品溶液各50 μL，揮去甲醇，按黃芩苷供試品制備方法進(jìn)行制備，測定,計(jì)算黃芩苷的回收率。測得黃芩苷的回收率為100.10%，RSD為2.21%。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 分別取柴胡皂苷a對(duì)照品和黃芩苷對(duì)照品，連續(xù)進(jìn)樣5次,每次10 μL, 計(jì)算得儀器精密度；測得柴胡皂苷a的RSD為2.93%，黃芩苷的RSD值為1.54%；表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一份大鼠腸灌流液各4 mL和30 μL，按供試品制備方法分別制得柴胡皂苷a和黃芩苷供試品溶液各5份，進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，柴胡皂苷a的RSD為1.44%；黃芩苷的RSD為1.13%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3 藥物穩(wěn)定性的考察 柴胡皂苷a在K-R液中2 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，在含姜組與無姜組中所得藥物濃度為原始藥物濃度的(97.88±3.59)%和(98.15±4.54)% (n=3)，而黃芩苷降解殘存率為(96.60±1.99)%和(95.51±1.63)% (n=3)，說明樣品在K-R液中基本穩(wěn)定。

在空白腸液中，2 h后含姜組與無姜組中柴胡皂苷a濃度為原始藥物濃度的(95.01±3.67)%和(97.31±3.93)% (n=3)，黃芩苷降解殘存率為(94.44±5.41)%和(96.40±3.71)% (n=3)，腸灌流實(shí)驗(yàn)為105 min，可認(rèn)為柴胡皂苷a和黃芩苷在實(shí)驗(yàn)過程中基本穩(wěn)定。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，腸灌流液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，灌流后收集的樣品應(yīng)立即冷凍保存或用甲醇稀釋，以免柴胡皂苷a和黃芩苷降解[8]。

2.4 腸壁和灌流管道吸附性考察 在37 ℃水浴條件下，離體大鼠小腸于藥液中孵育2 h，柴胡皂苷a在含姜組與無姜組中所得藥物濃度為原始藥物濃度的(99.27±3.63)%和(98.73±3.71)%(n=3)，黃芩苷的藥物濃度為原始藥物濃度的(97.35±4.56)%和( 98.73±3.71)% (n=3)，可認(rèn)為大鼠腸壁對(duì)藥物的物理吸附、代謝或攝取作用不明顯。

取蠕動(dòng)泵的灌流管道，置于腸灌流液中，于37 ℃水浴中孵育2 h，柴胡皂苷a在含姜組與無姜組中所得藥物濃度為原始藥物濃度的 (97.05±4.31)%和(95.47±5.62)%(n=3)，而黃芩苷的藥物濃度為原始藥物濃度的(95.73±3.16)%和( 97.50±2.15)% (n=3)，各組0 h與2 h進(jìn)行比較，均無顯著性差異(P>0.05)，可認(rèn)為灌流管道對(duì)藥物的物理吸附作用不明顯。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，收集灌流液前應(yīng)用K-R液充分沖洗腸道，避免腸內(nèi)容對(duì)小柴胡湯中有效物質(zhì)的吸附，灌流管道應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前后用K-R液充分清洗后再使用，避免柴胡皂苷a和黃芩苷在灌流管壁的殘余對(duì)樣品造成污染。

2.2.10 腸灌流液中吸收參數(shù)的測定 取適量小柴胡湯水煎液，用K-R液配制成腸灌流液。以回腸為灌流部位，采用大鼠在體單向腸灌流模型考察生姜對(duì)柴胡皂苷a和黃芩苷在腸道吸收的影響，結(jié)果見表1。由表1可知，含姜組小柴胡湯中柴胡皂苷a和黃芩苷在回腸的吸收均大于無姜組，且兩組間存在顯著性差異(P<0.05)，含姜組的Ka和Papp值均較無姜組增大了1.5倍，表明生姜對(duì)小柴胡湯中的柴胡皂苷a和黃芩苷腸道吸收可能有促進(jìn)作用。

表1 生姜對(duì)小柴胡湯中柴胡皂苷a和黃芩苷吸收參數(shù)的影響

3 討論

生姜在中藥復(fù)方中廣泛配伍使用，為探討生姜在復(fù)方中的配伍意義及機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典復(fù)方小柴胡湯為例，從腸道吸收角度，考察配伍生姜對(duì)小柴胡湯水煎液中柴胡皂苷a和黃芩苷在腸道吸收的影響。

小腸是大多數(shù)口服藥物主要的吸收部位, 預(yù)測藥物小腸吸收的方法主要有離體法和在體法。在體法中大鼠單向腸灌流法(SPIP)因不損傷研究部位的循環(huán)系統(tǒng)和生理環(huán)境從而能夠較好地模擬人體的體內(nèi)環(huán)境，且結(jié)果與人體試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性良好[2-3]，目前在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。灌流體積流量在一定程度上代表了腸道蠕動(dòng)的生理狀態(tài)，隨著灌流體積流量的增加，腸道的吸收速率常數(shù)顯著增加，說明腸道的蠕動(dòng)加快會(huì)使藥物吸收增加。人體腸灌流技術(shù)中多采用灌流液體積流量為2～3 mL/min，且人腸道直徑約10倍于大鼠腸道直徑[9]，故本實(shí)驗(yàn)大鼠單向灌流體積流量采用0.2 mL/min。

腸灌流實(shí)驗(yàn)中由于腸道對(duì)水分的吸收或分泌往往會(huì)導(dǎo)致灌流液體積隨時(shí)間變化,現(xiàn)多選用酚紅作為灌流液體積的“標(biāo)示物”，然而，灌流過程中酚紅往往也存在一定程度的腸吸收，且其本身還可能干擾某些化合物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)或分析測定[10]。與傳統(tǒng)的酚紅法相比，采用重量法對(duì)灌流液體積進(jìn)行校正，能更直接真實(shí)地反映腸道吸收水分的實(shí)際情況，從而提高了Ka和Papp值的準(zhǔn)確度[11]。

近年來的研究表明，腸道中真桿菌(E.SP.A-44)和雙歧桿菌(S.SP.Saiko-2)能水解柴胡皂苷，并從其中分離到2種水解柴胡皂苷的酶，這2種糖苷酶分別是SHGasehe 和PHFase。大多數(shù)的柴胡皂苷經(jīng)SHGasehe代謝為前柴胡苷元，再經(jīng)PHFase代謝為柴胡皂苷元。柴胡皂苷元在腸道內(nèi)被吸收進(jìn)入血液中，故柴胡皂苷元是發(fā)揮藥效的主要成分[12]。而真桿菌(E.SP.A-44)和雙歧桿菌(S.SP.Saiko-2)主要存在于結(jié)腸，回腸中有少量分布。黃芩苷在體內(nèi)的過程是先在胃腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化為黃芩素被吸收,然后在腸黏膜細(xì)胞內(nèi)復(fù)原為黃芩苷[13-14]而進(jìn)入體內(nèi)，雖然水解黃芩苷的菌群多分布于盲腸和結(jié)腸，但回腸部同樣有部分吸收[15]，由于結(jié)腸外富含脂肪組織，且結(jié)腸內(nèi)含大量腸代謝物，故實(shí)驗(yàn)中難以對(duì)結(jié)腸段進(jìn)行灌流，回腸段因腸道收縮性較好，易于取出沖洗，腸內(nèi)容物較少等，故實(shí)驗(yàn)中選擇回腸作為灌流腸段。

文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，柴胡皂苷a和黃芩苷均為腸道不易吸收的物質(zhì)，但與其他藥物配對(duì)使用時(shí)，可明顯增加藥物在腸道吸收的量，在柴胡-芍藥藥對(duì)配伍中，柴胡皂苷a能促進(jìn)芍藥苷的腸道吸收，可能與柴胡皂苷能打開Caco-2細(xì)胞間的緊密連接有關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在小柴胡湯復(fù)方水煎液柴胡皂苷a、黃芩苷在大鼠腸道的吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀吸收系數(shù)(Papp)均明顯高于文獻(xiàn)中對(duì)這兩個(gè)物質(zhì)單體腸吸收Ka、Papp數(shù)值，提示復(fù)方配伍應(yīng)用可能促進(jìn)了方中君藥、臣藥主要活性成分的小腸吸收。我們在前期實(shí)驗(yàn)中觀察到，生姜的配伍對(duì)小柴湯中黃芩苷的溶出無影響，而對(duì)柴胡皂苷a的溶出有影響，且生姜降低小柴胡湯中柴胡皂苷a的含有量。而本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察生姜對(duì)小柴胡湯復(fù)方中柴胡皂苷a和黃芩苷腸吸收的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在復(fù)方藥物配比、煎煮方法、腸道吸收條件等因素不變的情況下，生姜的配伍與否明顯影響了復(fù)方中主要活性成分柴胡皂苷a和黃芩苷在小腸的吸收，兩者之間存在顯著差異。配伍生姜能明顯提高水煎液中這些活性成分小腸吸收速率及吸收量，提示小柴胡湯中配伍應(yīng)用生姜的原理，除可能在于協(xié)調(diào)方中其他藥物在藥效上發(fā)揮作用外，還可能是因?yàn)樯艽龠M(jìn)方中君藥、臣藥主要活性成分的小腸吸收。生姜在其他復(fù)方中是否也存在同樣的配伍作用，以及其促進(jìn)吸收的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)從藥物代謝動(dòng)力學(xué)(如藥物吸收、代謝)的角度研究復(fù)方配伍原理，不僅有助于深化了解中藥配伍本質(zhì)，還為中醫(yī)藥配伍理論研究提供新思路。

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