黃瓜子不同提取部位對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的影響

裴啟洋， 佟 鑫， 賈天柱

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600)

黃瓜子為葫蘆科植物黃瓜CucumbersativusL.的干燥成熟種子。《中華本草》中記載黃瓜子具有續(xù)筋接骨、祛風(fēng)、消痰的功效，主治骨折筋傷、風(fēng)濕痹痛、老年痰喘[1]，在民間多用于接骨療傷，近年收載于《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]。黃瓜子在許多復(fù)方中有應(yīng)用且作用明顯，如骨折挫傷散等。但其接骨作用機(jī)制及在骨代謝過(guò)程中的細(xì)胞生物學(xué)作用尚未見(jiàn)報(bào)道，因此為了研究其藥理藥效作用，本實(shí)驗(yàn)選取細(xì)胞增殖、骨鈣素水平及堿性磷酸酶活性為指標(biāo)，觀察了生制黃瓜子不同提取部位及含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響，以此來(lái)評(píng)價(jià)黃瓜子對(duì)成骨細(xì)胞的作用，并為探討黃瓜子接骨作用機(jī)理及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 生品黃瓜子購(gòu)于安徽亳州，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為葫蘆科植物黃瓜CucumbersativusL.的干燥成熟種子；制品黃瓜子：以溫度計(jì)測(cè)量鍋底溫度，待溫度上升至120 ℃時(shí)，取生品黃瓜子置于鍋內(nèi)，保持鍋溫條件下炒制2 min至深黃色，取出放涼備用。

1.2 主要試劑 DMEM液體培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；胎牛血清(Gibco)；胰酶(Gibco)；Ⅱ型膠原酶(Gibco)；CCK-8(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)；骨鈣素放免試劑盒(南京建成生物工程研究所)；堿性磷酸酶酶免試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡(Olympus，日本)；CO2培養(yǎng)箱(sanyo，日本)；Multuskan Mk3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.4 動(dòng)物 1 d齡SD新生大鼠及SD雌性大鼠均購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(遼)2008-0002。

2 方法

2.1 新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)[3-5]取1 d齡SD大鼠用75%乙醇消毒5 min后置于培養(yǎng)皿中，取出顱骨，置PBS液內(nèi)清除骨膜、血管及結(jié)締組織等，剪成1 mm2的碎片；將骨片移入0.25%胰酶中，于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃消化20 min；棄去消化液，加入0.1%Ⅱ型膠原酶，于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃消化2 h；用100目篩網(wǎng)將消化液濾過(guò)至離心管，加入培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心10 min后棄去上清液，向離心管中加入15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)血清培養(yǎng)液)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL， 接種于培養(yǎng)瓶，于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，24 h后換液，以后每?jī)扇論Q液一次；待原代細(xì)胞(見(jiàn)圖1)80%鋪滿瓶底時(shí)以1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并依上法加血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)、傳代，取第3代成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 原代成骨細(xì)胞(20x)

2.2 黃瓜子的提取及含藥血清的制備 取黃瓜子生、制品粗粉，70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液經(jīng)濃縮后，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。收集各萃取液，蒸干后加純凈水配成相當(dāng)于飲片生藥量為1 g/mL的藥液，分別為：生品石油醚層、生品乙酸乙酯層、生品正丁醇層、生品水層、制品石油醚層、制品乙酸乙酯層、制品正丁醇層、制品水層。取SD雌性大鼠隨機(jī)分為9組，每組6只，其中8組分別為生品石油醚層、生品乙酸乙酯層、生品正丁醇層、生品水層、制品石油醚層、制品乙酸乙酯層、制品正丁醇層、制品水層，用藥劑量根據(jù)黃瓜子臨床成人一日用量[2]與人和動(dòng)物體積表面折算和等效劑量比率表[6]進(jìn)行折算后，按1 mL/100 g給藥量灌胃上述提取的相應(yīng)藥液，剩余一組灌胃生理鹽水，記為空白對(duì)照組，每日1次，連續(xù)7 d，最后一次給藥后2 h，用3%的水合氯醛腹腔注射麻醉(1 mL/100 g)，腹主動(dòng)脈取血，離心得血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)試藥的制備 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中根據(jù)黃瓜子臨床成人一日用量[2]與人和動(dòng)物體積表面折算和等效劑量比率表[6]進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牧啃шP(guān)系考察，最終確定兩種培養(yǎng)液的配制方法與給藥劑量如下。

2.3.1 含藥培養(yǎng)液 將“2.2”項(xiàng)下提取的黃瓜子生、制品各提取部位蒸干稱(chēng)定質(zhì)量，溶于DMSO中，配成相當(dāng)于飲片含黃瓜子提取物為50 mg/mL的藥液，再加無(wú)血清培養(yǎng)液將其稀釋至5×10-2mg/mL，0.22 μm過(guò)濾除菌，得含藥培養(yǎng)液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 含藥血清培養(yǎng)液 將“2.2”項(xiàng)下所得血清室溫融化，再加無(wú)血清培養(yǎng)液將其稀釋至含15%含藥血清的培養(yǎng)液，0.22 μm過(guò)濾除菌，得含藥血清培養(yǎng)液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 細(xì)胞加藥培養(yǎng)及檢測(cè)[7-8]

2.4.1 黃瓜子不同提取部位對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 選擇第3代成骨細(xì)胞，用血清培養(yǎng)液調(diào)配細(xì)胞密度為0.5×105/mL，鋪入96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后換無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液；向96空孔板中加入“2.3”項(xiàng)下制備的培養(yǎng)液，每藥重復(fù)4孔，每孔200 μL，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液(以制品正丁醇組為例，加藥培養(yǎng)前后見(jiàn)圖2，圖3)，每孔加入CCK-8試劑50 μL，培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀于405 nm處測(cè)定其吸光度值，所得吸光度值用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)算公式如下：細(xì)胞增殖率=[(A加藥-A對(duì)照)/A對(duì)照]×100%

圖2 加藥培養(yǎng)前的成骨細(xì)胞(10×)

2.4.2 黃瓜子不同提取部位對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)骨鈣素水平及堿性磷酸酶活性的影響 參照“2.4.1”項(xiàng)下加藥培養(yǎng)細(xì)胞的方法，加藥培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，吸出細(xì)胞懸液至EP管中，反復(fù)凍融以使細(xì)胞破碎，其上清液以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測(cè)定骨鈣素水平，以微量酶標(biāo)法測(cè)定堿性磷酸酶活性。

3 結(jié)果

3.1 黃瓜子對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 生、制黃瓜子不同提取部位的含藥培養(yǎng)液及含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均有明顯的促進(jìn)作用，結(jié)果見(jiàn)表1～2。

3.2 黃瓜子對(duì)成骨細(xì)胞骨鈣素水平的影響 生、制黃瓜子正丁醇及乙酸乙酯提取部位的含藥培養(yǎng)液及含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞骨鈣素的合成有一定促進(jìn)作用，結(jié)果見(jiàn)表3～4。

3.3 黃瓜子對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 生、制黃瓜子正丁醇及乙酸乙酯提取部位的含藥培養(yǎng)液及含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性有一定促進(jìn)作用，結(jié)果見(jiàn)表5～6。

表1 含藥培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

表2 含藥血清培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

表3 含藥培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞骨鈣素水平的影響

4 討論

成骨細(xì)胞是骨代謝過(guò)程中的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，并在骨修復(fù)過(guò)程中與破骨細(xì)胞相互協(xié)調(diào)，參與破骨細(xì)胞骨吸收功能的調(diào)節(jié)，在骨代謝過(guò)程中有極為重要的作用。成骨細(xì)胞數(shù)量不足或功能減退都會(huì)影響骨的修復(fù)過(guò)程，并可能引發(fā)骨質(zhì)疏松癥等骨疾病，因此提高成骨細(xì)胞的增殖和分化水平是防治此類(lèi)疾病的關(guān)鍵[9]。所以本實(shí)驗(yàn)選取成骨細(xì)胞增殖、骨鈣素水平及堿性磷酸酶活性為指標(biāo)，觀察生制黃瓜子不同提取部位及其含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖及分化的影響，來(lái)評(píng)價(jià)黃瓜子在骨代謝過(guò)程中對(duì)成骨細(xì)胞的作用。

表4 含藥血清培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞骨鈣素水平的影響

表5 含藥培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

表6 含藥血清培養(yǎng)液對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

成骨細(xì)胞在體內(nèi)外均可增殖，而成骨細(xì)胞數(shù)量的增加會(huì)生成更豐富的膠原，促使生成更多的骨組織；反之，成骨細(xì)胞過(guò)度凋亡導(dǎo)致骨形成量不足，就會(huì)引發(fā)骨折和骨質(zhì)疏松等疾病[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃瓜子各提取部位對(duì)成骨細(xì)胞增殖均具有促進(jìn)作用，說(shuō)明黃瓜子的接骨作用是通過(guò)加快成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，達(dá)到促進(jìn)骨形成和修復(fù)的目的。

骨鈣素又稱(chēng)骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是由成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白，是構(gòu)成骨基質(zhì)的成分之一，為骨基質(zhì)中含量最多的非膠原蛋白，其功能是保證骨的正常礦化[11]，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志之一。堿性磷酸酶由成骨細(xì)胞分泌，它既可做為成骨細(xì)胞的功能標(biāo)記物，又可反映其分化成熟程度，是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示生制黃瓜子正丁醇及乙酸乙酯提取部位能促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨鈣素分泌及提高堿性磷酸酶活性，說(shuō)明該提取部位的化學(xué)成分能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與成熟，生成更多的骨基質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)接骨作用。

另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示炮制品作用普遍優(yōu)于生品，這可能是因?yàn)辄S瓜子經(jīng)炮制后其有效化學(xué)成分的溶出度增加，或者炮制過(guò)程中發(fā)生了化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化致使有效成分總量增加，有待進(jìn)一步研究。

目前，在研究中藥對(duì)體外細(xì)胞的作用時(shí)，多采用將中藥提取液直接與細(xì)胞共同培養(yǎng)的模式。本實(shí)驗(yàn)為盡量模擬體內(nèi)環(huán)境，在采用中藥提取液直接與細(xì)胞共同培養(yǎng)模式的同時(shí)，還進(jìn)行了含藥血清與細(xì)胞培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，以分析藥物進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)代謝后對(duì)成骨細(xì)胞的影響。對(duì)促成骨細(xì)胞生長(zhǎng)與分化過(guò)程中起主要作用的乙酸乙酯層及正丁醇層，其相應(yīng)含藥血清組與原含藥培養(yǎng)液組相比，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上并未體現(xiàn)出明顯差別，說(shuō)明黃瓜子中促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的化學(xué)成分受胃腸道及血液代謝的影響很??；空白血清組相較無(wú)血清組其成骨細(xì)胞骨鈣素水平與堿性磷酸酶活性也有一定提高，提示大鼠血清中也含有可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與成熟的成分。

黃瓜子正丁醇提取部位在成骨細(xì)胞增殖、骨鈣素水平及堿性磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)了比其他提取部位更強(qiáng)的促進(jìn)作用，提示黃瓜子提高成骨細(xì)胞增殖和分化水平進(jìn)而促進(jìn)骨形成及修復(fù)過(guò)程的物質(zhì)基礎(chǔ)主要存在于正丁醇提取部位。另外巴戟天[13]、狗脊[5]等藥物作用于成骨細(xì)胞的提取部位同為正丁醇層，提示各中藥對(duì)成骨細(xì)胞起促進(jìn)作用的成分可能主要集中在正丁醇提取部位，有可能為一類(lèi)具有相似結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相近的化合物，這為繼續(xù)研究該類(lèi)藥物對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：第5卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:522.

[2] 遼寧省食品藥品監(jiān)督管理局.遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第1冊(cè)[M].沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2009:175-179.

[3] Wang Xi, Huang Jian, Zhang Tianlan,etal. Cytoskeleton reorganization and FAK phosphorylation are involved in lanthanum (III)-promoted proliferation and differentiation in rat osteoblasts[J].ProNatSci,2009,19(3):331-335.

[4] 邢國(guó)勝,談志龍,王淑云,等.補(bǔ)腎健骨湯對(duì)成骨細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶、骨鈣素合成的影響[J].中草藥,2001,32(11):1020-1022.

[5] 于海濤,李 慧,賈天柱,等. 狗脊炮制品中促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化成分的篩選[J].中成藥,2012,34(6):1139-1142.

[6] 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:589.

[7] Zhang Dawei, Cheng Yan, Zhang Jinchao,etal. Cytotoxic effects of flavonol glycosides and nonflavonoid constituents of Epimedium koreanum on primary osteoblasts[J].PharmBiology,2008,46(3) : 185-190.

[8] Harada S I, Rodan G A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass[J].Nature,2003,423(6937) : 349-355.

[9] 孔祥鶴,牛銀波,王婷梅,等.黃芪多糖對(duì)大鼠原代成骨細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究[J].中草藥,2011,42(10):2065-2069.

[10] Weinstein R S,Manolagas S C.Apoptosis and osteoporosis[J].AmJMed,2000,108(2):153-164.

[11] Lian J B, Gunderg C M. Osteoealcin．Biochemical consideration and clinial applications[J].ClinOrthopRelRes,1987,226(2):267-270.

[12] 安亞蘭,王建舫,許水明,等.補(bǔ)骨脂水提液及補(bǔ)骨脂素對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(2) : 266-271.

[13] 凌 昆,趙 詣,郭素華.巴戟天藥物血清對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(6):846-849.