環(huán)氧化酶2參與遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

尹潔 閆峰 李森 羅玉敏 趙詠梅

缺血性腦血管病已成為當(dāng)今重要的高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，腦缺血損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚不完全清楚。1986年Murry等[1]發(fā)現(xiàn)：對(duì)器官給予短暫的非致死性缺血處理后，可使其對(duì)之后的致死性缺血產(chǎn)生耐受，稱為缺血預(yù)適應(yīng)。但缺血預(yù)適應(yīng)直接作用于靶器官，不適用于心臟和腦。遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)(remote ischemic preconditioning, RIPC)是指通過一個(gè)器官的重復(fù)缺血/缺氧，在提高該局部器官組織對(duì)缺血/缺氧耐受的同時(shí)，也顯著增強(qiáng)其他遠(yuǎn)隔的靶器官或組織對(duì)缺血/缺氧的耐受能力。RIPC不直接作用于靶器官，而是在其他非重要器官進(jìn)行，避免了對(duì)重要器官(如腦和心臟)靶器官直接進(jìn)行預(yù)適應(yīng)可能引起的缺血風(fēng)險(xiǎn)，因此近年來受到許多學(xué)者的關(guān)注。

環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2， COX2)是炎性介質(zhì)前列腺素生物合成的限速酶，具有神經(jīng)損傷作用[2]。近年來，有大量研究表明COX2參與心臟缺血再灌注損傷，并且參與心肌缺血預(yù)適應(yīng)的晚期保護(hù)機(jī)制[3]。然而，有關(guān)COX2在腦的RIPC中的研究尚未見報(bào)道。本研究采用后肢RIPC方法對(duì)大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠進(jìn)行保護(hù)，探討RIPC對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料小動(dòng)物呼吸機(jī)(Harvard Apparatus 683，美國(guó))、雙極電凝(德威，DEVEL, ACC100)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus，美國(guó))、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss,德國(guó))。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)，COX2多克隆抗體(CST公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)，β-actin抗體(Sigma公司)，ECL檢測(cè)試劑盒(Millipore公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)，Western blotting膜再生液(北京普利萊基因公司)

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量280～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室，自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)前采用隨機(jī)分組分為3組，假手術(shù)(Sham)組、MCAO組和RIPC+MCAO組，每組8只大鼠。

1.2.2動(dòng)物模型制作：(1)RIPC[4]：RIPC+MCAO組進(jìn)行RIPC。首先分離大鼠雙側(cè)股動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)股動(dòng)脈10 min，之后松開動(dòng)脈夾，再灌注10 min，構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，每天連續(xù)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，連續(xù)進(jìn)行3 d。其余兩組大鼠只切開皮膚后縫合。(2)MCAO 模型制作：第4天MCAO組和RIPC+MCAO組進(jìn)行MCAO 模型制作。采用改良Zea Longa法[5]制備大鼠MCAO模型。大鼠稱重后用5%恩氟烷混合70% N2O、30% O2誘導(dǎo)麻醉，2%恩氟烷混合70% N2O、30% O2維持麻醉(均為體積分?jǐn)?shù))。頸正中切口分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，將頭端直徑0.38 mm的尼龍線栓由頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至距頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處約18 mm。術(shù)中使用反饋性控溫毯檢測(cè)大鼠肛溫，將大鼠體溫維持在36.5℃～37.5℃。監(jiān)測(cè)心率及平均動(dòng)脈壓，使各項(xiàng)生理參數(shù)保持在正常范圍。線栓插入2 h后拔出。Sham組相應(yīng)皮膚切開分離血管后不插栓即縫合。

1.2.3神經(jīng)功能評(píng)分：用改進(jìn)的Longa評(píng)分法[6]在腦缺血再灌注24 h后對(duì)3組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：正常；1分：腦缺血對(duì)側(cè)的前肢不能伸展；2分：腦缺血對(duì)側(cè)的前肢屈曲；3分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物向缺血對(duì)側(cè)輕度轉(zhuǎn)圈；4分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物明顯向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；5分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物爬行時(shí)向缺血對(duì)側(cè)傾倒。術(shù)后評(píng)分1～4分者為MCAO模型制作成功，入組；0分、5分者均視為MCAO模型制作失敗，剔除，用相同造模方法補(bǔ)足。

1.2.4TTC染色：缺血再灌注24 h大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后，立刻斷頭取腦，橫斷面由前向后，取視交叉前4 mm及其后大腦做連續(xù)冠狀切片(層厚2 mm)，共取6片。將切片置于1 % (質(zhì)量濃度)TTC染色液中，37℃避光孵育 20 min，肉眼觀察正常腦組織呈玫紅色，梗死區(qū)腦組織呈白色。使用Image J軟件分析梗死體積。腦梗死體積分?jǐn)?shù)(%)=(健側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球體積)/ 健側(cè)大腦半球體積×100 % = 〔(S1’ + S2’ + …+ S6’) H -(S1+S2+…+S6)×H〕/(S1’+S2’+…+S6’)×H×100%，Sn’表示每片健側(cè)腦組織面積，Sn表示每片梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織面積，H表示每片厚度[7]。

1.2.5Western blotting檢測(cè)腦梗死側(cè)COX2蛋白表達(dá)：將梗死側(cè)腦組織在組織裂解液中研磨、裂解，以12 000 r/min(離心半徑16 cm)于4℃離心30 min，吸取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)泳道取50 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉2 h。NC膜先與抗-COX2抗體(1∶1000稀釋)反應(yīng)過夜后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3000)室溫孵育1 h，ECL試劑盒檢測(cè)條帶；NC膜經(jīng)Western blotting膜再生液再生后，再次用5%脫脂奶粉封閉，與抗β-actin抗體(1∶1000稀釋)反應(yīng)過夜后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3000)室溫孵育1 h，ECL試劑盒檢測(cè)條帶。采用Image J凝膠圖像處理系統(tǒng)計(jì)算每組COX2及相應(yīng)β-actin條帶的平均灰度值，以COX2平均灰度值與β-actin平均灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Sham組0分，RIPC+MCAO組神經(jīng)功能評(píng)分低于MCAO組(P<0.05，表1)。

2.2各組大鼠腦梗死體積比較Sham組大鼠無腦梗死發(fā)生。RIPC+MCAO組大鼠腦梗死體積比MCAO組大鼠明顯減少(P<0.05，表1、圖1)。

圖1各組大鼠再灌注24 h時(shí)腦梗死體積比較(TTC染色)

2.3大鼠腦梗死側(cè)COX2蛋白表達(dá)MCAO組和RIPC+MCAO組大鼠腦梗死側(cè)COX2蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于Sham組(P<0.05)；RIPC+MCAO組COX2蛋白相對(duì)表達(dá)低于MCAO組(P<0.05)(表1、圖2)。

圖2各組大鼠再灌注24 h時(shí)腦梗死側(cè)COX2蛋白表達(dá)(Western blotting法)

3 討論

近年來，缺血預(yù)適應(yīng)作為腦缺血損傷的有效保護(hù)策略，引起了人們的廣泛關(guān)注。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，心外組織如腎、小腸及骨骼肌等短暫缺血還對(duì)遠(yuǎn)隔組織和器官有保護(hù)作用，這一現(xiàn)象即RIPC[1]。不同于在機(jī)體其他器官上進(jìn)行RIPC，采用肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腦或其他重要生命器官進(jìn)行缺血損傷的保護(hù)，更適合于向臨床轉(zhuǎn)化。因此深入研究RIPC對(duì)腦缺血的保護(hù)作用并探討其相關(guān)機(jī)制，對(duì)臨床應(yīng)用RIPC治療缺血性腦血管病具有重要意義。

表 1 各組大鼠Longa評(píng)分、腦梗死體積分?jǐn)?shù)、COX2蛋白相對(duì)表達(dá)比較

與Sham組比較，*P< 0.05；與MCAO組比較，#P< 0.05

本研究采用改良Zea Longa法制作MCAO再灌注大鼠模型，在模型制作過程中監(jiān)測(cè)大鼠的生理參數(shù)，使各項(xiàng)生理參數(shù)保持在正常范圍且無明顯差異，基本排除了手術(shù)操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并在造模前連續(xù)3 d對(duì)部分大鼠進(jìn)行每天夾閉大鼠雙側(cè)股動(dòng)脈10 min/再灌注10 min連續(xù)3個(gè)循環(huán)的后肢RIPC，結(jié)果顯示，RIPC+MCAO組大鼠再灌注24 h后的神經(jīng)功能評(píng)分比MCAO組大鼠明顯降低，腦梗死體積明顯減小，提示后肢RIPC方法對(duì)腦缺血損傷可能有明顯保護(hù)作用。

COX是前列腺素G/H合成酶，是花生四烯酸代謝轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶。哺乳動(dòng)物COX至少有2種異構(gòu)酶：結(jié)構(gòu)型(COX1)及誘導(dǎo)型(COX2)。在生理狀態(tài)下，COX2 mRNA及蛋白表達(dá)量少，但對(duì)維持正常生理功能起著一定作用。脂多糖、腫瘤壞死因子、血小板激活因子等許多炎性刺激因子均可誘導(dǎo)COX2的表達(dá)。近年來一些研究提示，COX2參心肌及腦缺血損傷，并與心、腦缺血的預(yù)后關(guān)系密切[3，8]。在小腸進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)能夠明顯減輕心臟的缺血再灌注損傷，表明COX2參與了心臟RIPC的保護(hù)作用[9]。但有關(guān)COX2在RIPC對(duì)腦缺血再灌注損傷中作用的研究尚未見報(bào)道。

COX2能使促炎介質(zhì)類前列腺素和活性氧自由基表達(dá)增加，進(jìn)而加重缺血性腦損傷[8]。羅玉敏等[10]的研究發(fā)現(xiàn)COX2基因完全敲除小鼠的腦梗死體積和前列腺素E2(PGE2)含量顯著降低，也提示COX2參與腦缺血損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血2 h再灌注24 h后，MCAO組和RIPC+MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織COX2蛋白表達(dá)明顯增加，且Longa評(píng)分顯著升高，腦梗死體積分?jǐn)?shù)明顯增大，也表明COX2參與腦缺血再灌注損傷。同時(shí)，RIPC+MCAO組大鼠在再灌注24 h后梗死側(cè)COX2 蛋白表達(dá)與單純MCAO組大鼠相比明顯下降，提示RIPC可能抑制了腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)COX2蛋白的表達(dá)上調(diào)，RIPC很可能通過抑制COX2表達(dá)發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，與MCAO組大鼠相比，腦缺血2 h再灌注24 h后RIPC+MCAO組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，腦梗死體積明顯減小，梗死側(cè)腦組織COX2蛋白表達(dá)明顯下降，提示后肢RIPC能通過降低MCAO大鼠COX2表達(dá)對(duì)腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。該結(jié)果為研究后肢RIPC的腦保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制提供了直接證據(jù)，對(duì)臨床應(yīng)用后肢RIPC治療缺血性腦血管病可能具有一定理論指導(dǎo)意義。

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