自身免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)EAMG模型小鼠發(fā)病的影響

杜偉偉 李勁頻 陳澤志 劉競(jìng)麗 莫雪安 孫圣剛

中樞淋巴器官(包括骨髓和胸腺)是免疫細(xì)胞發(fā)生、分化和成熟的場(chǎng)所。骨髓中含有骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞，造血干細(xì)胞是存在于骨髓中的一群原始細(xì)胞，最終可分化成包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的各種血液細(xì)胞成分，不成熟的T細(xì)胞自骨髓遷移至胸腺，在胸腺中經(jīng)過(guò)陽(yáng)性選擇和陰性選擇后成為成熟的T細(xì)胞進(jìn)入到外周循環(huán)，如果在胸腺陽(yáng)性選擇或陰性選擇過(guò)程中出現(xiàn)異常，將會(huì)導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞的逃逸或CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的發(fā)育缺陷。自身抗原在胸腺內(nèi)的異位基因表達(dá)與T細(xì)胞胸腺選擇的結(jié)局密切相關(guān)；高水平自身抗原的表達(dá)能誘導(dǎo)完全性耐受，低水平自身抗原的表達(dá)只能誘導(dǎo)有限的抗原特異性耐受。自身免疫調(diào)節(jié)因子(autoimmune regulator, AIRE)能夠控制胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞自身抗原表達(dá)水平，是中樞耐受維持的一個(gè)重要調(diào)控者。研究證實(shí)，在重癥肌無(wú)力中，胸腺自身抗原乙酰膽堿受體(AChR)的表達(dá)受AIRE的調(diào)控[1]。

Treg細(xì)胞與AIRE均在維持自身免疫耐受中起作用，然而兩者之間的關(guān)系尚未闡明。某些研究發(fā)現(xiàn)兩者有協(xié)同作用，同時(shí)缺失兩種因子的小鼠患病要較單一因子缺失的小鼠更為嚴(yán)重[2]；而在AIRE敲除的小鼠中，Treg細(xì)胞具有正常活性[3]。作者研究小組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(EAMG)小鼠Treg細(xì)胞比例減少，與其發(fā)病有關(guān)[4]。目前，關(guān)于重癥肌無(wú)力中AIRE的作用及與Treg細(xì)胞關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。該研究通過(guò)檢測(cè)EAMG小鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)AIRE基因、AChRα1亞基基因表達(dá)水平及CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例，旨在探討AIRE在重癥肌無(wú)力發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6雌性小鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCX粵2004-0001)70只，8～10周齡，體質(zhì)量15～27 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，采用隨機(jī)數(shù)字表分為3組：實(shí)驗(yàn)組40只，福氏佐劑(CFA)對(duì)照組15只，健康對(duì)照組15只。

1.2主要儀器和試劑包括Epics XL型流式細(xì)胞儀( Beckman Coulter公司)、9700型PCR儀(ABI PE公司)、垂直電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司產(chǎn)品)和核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf 公司)，AIRE、AChRα1、β-actin引物為日本Takara公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1EAMG造模及評(píng)價(jià)：按文獻(xiàn)[5]方法建立EAMG模型，即采用親和層析法從電鰩電器官中提取和純化AChR，并用其免疫C57BL/6小鼠。根據(jù)臨床癥狀及重復(fù)電刺激試驗(yàn)結(jié)果判斷造模是否成功：臨床癥狀及重復(fù)電刺激均為陽(yáng)性者為成模組，有22只；臨床癥狀及重復(fù)電刺激均為陰性的為未成模組，有16只；僅具有臨床癥狀，而重復(fù)神經(jīng)電刺激檢測(cè)為陰性的2只小鼠予以排除。福氏佐劑對(duì)照組皮下注射磷酸鹽緩沖液(PBS)/CFA混合物，健康對(duì)照組不作任何處理，同條件飼養(yǎng)。

1.3.2胸腺非特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)：小鼠脫頸椎處死，無(wú)菌取胸腺，用注射器芯隔著鋼網(wǎng)研磨，用10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(FCS)-DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞水平至1×107個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，設(shè)3復(fù)孔。每只小鼠設(shè)刀豆球蛋白A(ConA)組和對(duì)照組，ConA組每孔加入100 μL ConA(終濃度為5 μg/mL)，對(duì)照組每孔加入等量的培養(yǎng)液，置37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。細(xì)胞收獲前5 h，每孔取140 μL培養(yǎng)上清-20℃凍存，用于細(xì)胞因子的檢測(cè)，然后每孔加入10 μL甲基噻唑基四唑(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)各100 μL，震蕩10 min以溶解結(jié)晶顆粒，待結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度值〔D(λ)〕。用刺激指數(shù)SI表示胸腺細(xì)胞的非特異性增殖能力。SI=D(λ)ConA組/D(λ)對(duì)照組。

1.3.3CD4+和CD4+CD25+細(xì)胞水平檢測(cè)：小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌取胸腺，用注射器芯隔著鋼網(wǎng)研磨制成單細(xì)胞懸液，加冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗懸浮細(xì)胞，以83.85g離心10 min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞，取106個(gè)細(xì)胞(200 μL體積)，加入PE-anti-CD4和FITC-anti-CD25各1 μL，避光冰浴30 min，冷PBS洗滌2次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+胸腺細(xì)胞中Treg相對(duì)水平。

1.3.4AIRE及 AChRα1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：(1)總RNA的提?。核行叵贅悠方?jīng)液氮處理后制成粉末，移入無(wú)Rnase污染的Ep管中，以83.85g離心5 min后棄上清，沉淀中加入Trizol試劑1 mL，室溫孵育5 min，加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫孵育2 min，4℃ 12074.4g離心15 min，將水相移入新管中，加入異丙醇0.5 mL充分混勻，室溫孵育10 min，4℃ 12074.4g離心15 min，吸棄液體，80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇1 mL洗2次，4℃ 5366.4g離心5 min，空氣干燥5～10 min，13 μL無(wú)RNA酶(Rnase)水溶解RNA，55℃水浴10 min，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA含量。當(dāng)D(λ)260 nm/D(λ)280 nm>1.7，用于進(jìn)行RT-PCR。(2)RT-PCR：PCR反應(yīng)條件：AIRE為：94℃預(yù)變性2 min，94℃ 45 s，57℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。最后72℃ 10 min。AChRα1為：94℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)行：94℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s， 30個(gè)PCR循環(huán)，最后在72℃繼續(xù)延伸8 min。以β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)條件為94℃ 2 min，94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，25個(gè)循環(huán)。根據(jù)Genebank中AIRE、AChRα1和β-actin基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。AIRE (sense：5′> CAGACCATGGCAGCTTCTGTCCAG<3′，antisense：5′>GAGGCAGCAGGAGCATCTCCAGAG<3′)。AChRα1(sense：5′>CTATGACGGCTCTGTGGT<3′，antisense：5′>CAGGCAGGGAATGATGAC <3′。β-actin(sense:5′>TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC<3′,antisense:5′>TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG<3′。(3)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻，上樣后在2%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠作水平電泳。電泳緩沖液為1×氨基丁三醇-硼酸(TBE)，電壓為120 V，電泳1 h。溴化乙啶染色，在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上成像，用Bio-Rad Quantity one Quantitation software進(jìn)行圖像分析，用AIRE、AChRα1亞基產(chǎn)物的D(λ)值與β-actin的D(λ)值的比值作為AIRE、AChRα1亞基的相對(duì)水平。以MBI 100 bp DNA marker 為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)，如各組數(shù)據(jù)方差齊則應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗(yàn)；如各組數(shù)據(jù)方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)中的多個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，應(yīng)用Kruskal-Wallis Test，兩兩比較應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胸腺非特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)健康對(duì)照組、CFA對(duì)照組、未成模組、成模組SI指數(shù)分別為1.055±0.046、1.073±0.051、1.089±0.045、1.428±0.059，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=237.5653，P=0.0000)。成模組SI顯著高于與未成模組、CFA佐劑組及健康對(duì)照組(P<0.01)，而未成模組、CFA佐劑組及健康對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2胸腺CD4+和CD4+CD25+細(xì)胞水平各組胸腺內(nèi)CD4+T細(xì)胞相對(duì)水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.0034，P=0.1223)，而Treg/CD4+T細(xì)胞水平各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=17.5610，P=0.0000)，成模組胸腺細(xì)胞內(nèi)Treg/CD4+T比例較其他3組明顯下降(P<0.01)(表1)。

2.3胸腺AIREmRNA和AChRα1mRNA表達(dá)水平成模組胸腺AIRE mRNA和AChRα1 mRNA表達(dá)水平顯著低于未成模組、CFA佐劑組及健康對(duì)照組(P<0.01)，而未成模組、CFA佐劑組及健康對(duì)照組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1，圖1)。

3 討論

胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞中組織特異性抗原基因的表達(dá)被稱為“異位基因表達(dá)”。Pugliese等[6]研究發(fā)現(xiàn)，如果一種抗原在胸腺內(nèi)不能高水平表達(dá)，則其相應(yīng)的抗原特異性胸腺細(xì)胞就有可能逃脫克隆清除而進(jìn)入外周引起自身免疫病的發(fā)生。Mesnard-Rouiller等[7]發(fā)現(xiàn)抗原的特異性耐受程度與自身抗原的表達(dá)水平密切相關(guān)，高水平自身抗原的表達(dá)能誘導(dǎo)完全性耐受，低水平自身抗原的表達(dá)只能誘導(dǎo)有限的抗原特異性耐受。AIRE主要位于胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞內(nèi)，其功能與中樞免疫耐受的維持有關(guān)[8-9]。Anderson等[10]采用基因芯片技術(shù)對(duì)AIRE基因敲除小鼠胸腺上皮細(xì)胞的“異位基因”表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，闡明了AIRE可以調(diào)節(jié)多種外周組織特異性抗原在胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄。在AIRE基因缺陷鼠，外周組織特異性抗原在胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞的表達(dá)降低。Scarpino等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AIRE基因敲除小鼠胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞的乙酰膽堿α亞基基因表達(dá)明顯降低。

表 1 各組小鼠胸腺CD4+、CD4+CD25+細(xì)胞、AIRE及 AChRα1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與另3組分別比較，*P<0.01

M：Marker；1、2：成模組；3、4：未成模組；5、6：CFA對(duì)照組；7、8：正常對(duì)照組

圖1各組小鼠胸腺AIRE及 AChRα1 mRNA電泳圖

該研究發(fā)現(xiàn)，成模組小鼠胸腺AChRα1 mRNA表達(dá)水平顯著低于未成模組、CFA佐劑組及健康對(duì)照組，表明EAMG小鼠存在自身抗原胸腺內(nèi)異位表達(dá)缺陷，這與其發(fā)病可能有關(guān)；同時(shí)成模組小鼠胸腺AIRE mRNA表達(dá)下降，且與胸腺AChRα1亞基mRNA表達(dá)降低水平一致，而未成模小鼠胸腺AIRE mRNA表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)成模鼠胸腺中AChRα1亞基的表達(dá)下降可能與其胸腺中AIRE的低表達(dá)有關(guān)。AIRE通過(guò)影響胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞自身抗原AChRα1亞基表達(dá)，在EAMG的中樞免疫耐受機(jī)制中起作用。Aricha等最近研究發(fā)現(xiàn)，AIRE敲除小鼠對(duì)自身免疫性重癥肌無(wú)力較野生型小鼠更易感，并且AIRE與Treg細(xì)胞有關(guān)[12]。

Treg細(xì)胞主要產(chǎn)生于正常胸腺，是一種功能成熟的T細(xì)胞亞群，其具有抑制抗原特異性反應(yīng)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的功能，也與免疫耐受的維持有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)，成模鼠胸腺內(nèi)CD4+T細(xì)胞水平不變，其非特異增殖能力增強(qiáng)，而CD4+CD25+細(xì)胞比例減少，表明成模鼠存在自身反應(yīng)胸腺細(xì)胞活性增強(qiáng)和Treg細(xì)胞比例降低，反映成模鼠可能存在自身反應(yīng)T細(xì)胞陰性選擇和Treg胸腺選擇的缺陷。此外，Apostolou等[13]研究發(fā)現(xiàn)自身抗原在胸腺細(xì)胞上異位表達(dá)可以誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生的增加。該研究結(jié)果顯示EAMG小鼠胸腺中AChRα1亞基表達(dá)下降，這也可能是其胸腺內(nèi)Treg細(xì)胞減少的原因之一。而AIRE能夠影響胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞自身抗原AChRα1亞基表達(dá)，因此AIRE可能通過(guò)對(duì)自身抗原AChR的調(diào)節(jié)間接影響Treg細(xì)胞的數(shù)量。

綜上所述，AIRE通過(guò)多種機(jī)制影響中樞免疫耐受從而可能在重癥肌無(wú)力的發(fā)病中起作用，但其具體途徑尚需進(jìn)一步研究。

[1]Lang B, Vincent A. Autoimmune disorders of the neuromuscular junction[J]. Curr Opin Pharmacol, 2009,9:336-340.

[2]Chen Z, Benoist C, Mathis D. How defects in central tolerance impinge on a deficiency in regulatory T cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102 :14735-14740.

[3]Kekalainen E, Tuovinen H, Joensuu J,et al. A defect of regulatory T cells in patients with autoimmune polyendocrinopathy candidiasis-ectodermal dystrophy[J]. J Immunol, 2007, 178: 1208-1215.

[4]李勁頻，劉競(jìng)麗，莫雪安，等.CD4+CD25+T細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力中作用的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,29:394-396.

[5]李勁頻，孫圣剛，李方明，等.實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力小鼠模型的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,25:342-344.

[6]Pugliese A, Zeller M, Fernandez A, et al. The insulin gene is transcribed in the human thymus and transcription levels correlated with allelic variation at the INS VNTR-IDDM2 susceptibility locus for type 1 diabetes[J]. Nat Genet, 1997, 15:293-297.

[7]Mesnard-Rouiller L, Bismuth J, Wakkach A, et al. Thymic myoid cells express high levels of muscle genes[J].Neuroimmunol,2004,148:97-105.

[8]Akiyoshi H, Hatakeyama S,Pitkanen J,et al. Subcellular expression of autoimmune regulator is organized in a spatiotemporal manner[J]. J Biol Chem, 2004,279:33984-33991.

[9]Marx A, Hohenberger P, Hoffmann H, et al. The autoimmune regulator AIRE in thymoma biology: autoimmunity and beyond[J]. J Thorac Oncol, 2010,5:S266-272.

[10]Anderson MS, Venanzi ES, Klein L, et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein[J]. Science, 2002, 298:1395-1401.

[11]Scarpino S, Di Napoli A, Stoppacciaro A, et al. Expression of autoimmune regμLator gene (AIRE) and T regulatory cells in human thymomas[J]. Clin Exp Immunol, 2007,149:504-512.

[12]Aricha R, Feferman T, Scott HS, et al. The susceptibility of Aire(-/-) mice to experimental myasthenia gravis involves alterations in regulatory T cells[J]. J Autoimmu, 2011,36:16-24.

[13]Apostolou I, Sarukhan A, Klein L, et al, Origin of regulatory T cells with known specificity for antigen[J]. Nat Immunol, 2002,3:756-763.