蒙古沙冬青干旱脅迫全長cDNA文庫構(gòu)建及序列分析

林清芳，王學(xué)峰，李記園，趙鴻彬，王茅雁

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018

從基因組水平分離和鑒定植物干旱誘導(dǎo)表達(dá)基因是挖掘關(guān)鍵抗旱基因、探討植物抗旱性分子機(jī)理的重要前提，目前主要通過全長cDNA文庫和EST文庫技術(shù)開展此項工作。前者可高通量獲得基因的全長cDNA，相對于EST文庫技術(shù)，它在開展基因功能分析、正確進(jìn)行基因功能注釋和發(fā)現(xiàn)新基因等方面具有明顯優(yōu)勢[1-2]。SMART (Switching mechanism at 5′-end of RNA transcript) 技術(shù)是目前國內(nèi)外最常用的全長cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)之一，因其具有實(shí)驗程序簡單、快速和成本較低等優(yōu)點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于油菜和香蕉等多種植物全長cDNA文庫的構(gòu)建[3-4]。通過全長cDNA文庫結(jié)合表達(dá)譜分析技術(shù)，國內(nèi)外已對擬南芥和玉米等植物在干旱脅迫下的基因表達(dá)及其調(diào)控途徑進(jìn)行了研究，篩選出一批干旱誘導(dǎo)表達(dá)基因，為鑒定重要抗旱基因做出了貢獻(xiàn)[5-6]。然而，這些植物的抗旱性都很有限，而利用典型抗旱植物為材料開展此類研究尚未見報道。

沙冬青 Ammopiptanthus (Maxim.) Cheng f.是我國西北荒漠區(qū)特有的唯一常綠旱生闊葉灌木和珍稀瀕危植物，有蒙古沙冬青 (又名沙冬青，A. mongolicus) 和新疆沙冬青 (又名小/矮沙冬青，A. nanus) 兩個種。由于生境地嚴(yán)酷的自然條件，沙冬青在進(jìn)化中形成了極強(qiáng)的抗寒和抗旱等抗逆特性，可在?30 ℃和年降水量不足200 mm、年蒸發(fā)量在3 000 mm以上的嚴(yán)酷條件下生存，成為研究者關(guān)注的重要抗逆資源植物[7-8]。近年來，人們從沙冬青中分離出多個低溫誘導(dǎo)表達(dá)基因，其中一些基因如AmLEA、AmPI和AmEBP1可提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性[9-10]。郭九峰等從構(gòu)建的沙冬青冬季葉片 EST文庫中獲得360個UniEST序列[11]。這些工作為發(fā)掘沙冬青抗寒基因和探討其抗寒性分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。然而，至今尚未見到有關(guān)沙冬青抗旱基因分離及其抗旱性分子機(jī)理的研究報道。本文以蒙古沙冬青為材料，利用SMART技術(shù)構(gòu)建了其在干旱脅迫下的全長cDNA文庫，并對文庫進(jìn)行了規(guī)?；瘻y序和序列分析，為進(jìn)一步開展表達(dá)譜分析和高通量篩選其抗旱基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用沙培法將蒙古沙冬青培養(yǎng)至4個月，取出幼苗用水漂洗干凈，置于25 ℃下進(jìn)行自然干燥。分別在干燥0、1、3、6、12、24、48和72 h取葉片和根系。此外，在8月初取呼和浩特地區(qū)塑料大棚中連續(xù)6個月未澆水、已培育18個月的蒙古沙冬青幼葉作為自然干旱脅迫的樣品。所有樣品均在液氮中速凍后保存于?76 ℃，用于提取總RNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與mRNA分離

采用改進(jìn)的熱酚法[12]提取總 RNA，取少量樣品進(jìn)行電泳并測定OD值，以檢測其完整性、濃度和純度。將不同樣品總RNA各200 μg等量混合，按照試劑盒 (Promega公司) 說明分離mRNA，最后用DEPC水溶解。取少量樣品進(jìn)行電泳并測定OD值，以估測分子量和濃度。

1.2.2 SMART cDNA文庫構(gòu)建

按照SMARTTMcDNA Library Construction Kit (Clontech公司) 說明書進(jìn)行操作：

1) cDNA合成：取1 μg mRNA做模板合成cDNA第一鏈。雙鏈 cDNA合成采用 LD-PCR (Long-distance PCR) 方法，即在200 μL PCR管中加入10×Advantage 2 PCR緩沖液10 μL，第一鏈cDNA、50×dNTPs、5′PCR引物、CDSⅢ/3′PCR引物和50×Advantage 2聚合酶混合物各2 μL，ddH2O 80 μL，總體積100 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，68 ℃ 6 min，19個循環(huán)。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

2) cDNA純化與分級回收：將LD-PCR產(chǎn)物用蛋白酶K消化，再用SfiⅠ酶切，過Chroma Spin-400層析柱進(jìn)行分級分離，收集大于500 bp的片段合并為一管，沉淀后加去離子水7 μL溶解。

3) cDNA與載體連接和包裝：取1 μL雙鏈cDNA與1 μL λTriplEx2載體混合，用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接。取50 μL λDNA包裝蛋白 (Promega公司) 放于冰上融化，立即加入5 μL連接產(chǎn)物于22 ℃包裝3 h，然后加入445 μL噬菌體緩沖液和25 μL氯仿，混勻，離心，取上清即為原始文庫。

1.2.3 文庫質(zhì)量檢測

將文庫用稀釋緩沖液按1∶5和1∶15的體積比稀釋，各取1 μL轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL-Blue，與頂層瓊脂混勻、鋪平板，于37 ℃倒置培養(yǎng)。然后記數(shù)噬菌斑，按公式計算：

滴度 (PFU/mL) =噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×103(mL/L) /噬菌體鋪板體積 (μL)。

重組率 (%) =白斑數(shù)/(白斑數(shù)+籃斑數(shù)) ×100。

庫容量=文庫滴度 (PFU/mL) ×文庫體積(mL)。

根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)兩測序列設(shè)計 5′引物和3′引物 (序列見表1)，隨機(jī)挑取24個噬菌斑進(jìn)行PCR反應(yīng)，以檢測插入片段長度。

1.2.4 文庫環(huán)化及序列測定

取 20 μL原始文庫轉(zhuǎn)染大腸桿菌環(huán)化菌株BM25.8，使λTriplEx2重組噬菌體環(huán)化為質(zhì)粒形式。將部分環(huán)化菌液鋪平板，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，引物等同1.2.3。取陽性克隆送北京華大基因研究中心用Megabace 1 000和ABI3730xl測序儀進(jìn)行5′端測序。

1.2.5 序列分析

由北京華大基因研究中心代理序列分析?；静襟E是：用phred和cross-match程序獲取Clean EST序列；用phrap軟件對Clean EST序列進(jìn)行組裝，獲取 Unigene數(shù)據(jù)和冗余度 (冗余度=1?Unigenes數(shù)/組裝的 ESTs數(shù))；將Unigene序列與Nt、Nr和 Swissprot等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對和功能注釋，并用GO分類體系進(jìn)行功能分類。

1.2.6 基因表達(dá)分析

取自然干燥處理0 (CK)、1、3、8和24 h的蒙古沙冬青幼苗提取總 RNA (方法同 1.1和1.2.1)，然后反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以蒙古沙冬青AmACTIN基因作為內(nèi)參基因，用RT-PCR方法對文庫中的6個基因，即AmCaM (Calmodulin，鈣調(diào)素)、AmDREB (Dehydration-responsive elementbinding protein，脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)、AmTI (Trypsin inhibitor，胰蛋白酶抑制劑)、AmDHN (Dehydrin，脫水素)、AmEREBP (Ethyleneresponsive element-binding protein，乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白) 和AmCAT (Catalase，過氧化氫酶) 基因的表達(dá)變化進(jìn)行分析，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液1.5 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 1.2 μL、上下游引物 (10 μmol/L)各0.3 μL、cDNA模板X μL、rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.15 μL、ddH2O Y μL，總體積15 μL。PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 45 s，24 (AmACTIN) 或30 (其他基因)個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

表1 引物序列Table 1 The primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA文庫構(gòu)建及質(zhì)量檢測

用改進(jìn)的熱酚法提取總RNA，經(jīng)電泳檢測其28 S和18 S rRNA條帶清晰無拖尾，表明其完整性好，未降解 (圖略)。用紫外分光光度法測得不同樣品的OD260/280在1.9~2.1、OD260/230在1.9~2.3之間，表明蛋白質(zhì)、酚類、糖和鹽分等雜質(zhì)基本去除干凈，總RNA樣品純度較高，符合建庫要求。將不同干旱脅迫處理時間點(diǎn)的總RNA樣品等量混合分離 mRNA，經(jīng)電泳檢測其分布集中在500~3 000 bp之間，且看不到rRNA條帶(圖略)，表明其純度和完整性較好，可用于文庫構(gòu)建。

取mRNA作模板合成cDNA第一鏈，再經(jīng)LD-PCR合成雙鏈cDNA，經(jīng)電泳檢測其大小分布范圍超出 500~5 000 bp，主要分布區(qū)在750~2 000 bp之間 (圖1)，表明cDNA第一鏈的合成及其PCR擴(kuò)增反應(yīng)正常。

將LD-PCR產(chǎn)物用蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切，再經(jīng)層析柱分級分離，回收大于500 bp的片段，以1∶1比例與λTriplEx2載體連接。將連接產(chǎn)物進(jìn)行體外包裝，得到500 μL原始文庫。其滴度為1.6×107PFU/mL，重組率為97.7%，庫容量為 7.8×106，隨機(jī)克隆插入片段長度在600~2 300 bp之間，多數(shù)接近或超過1 000 bp (圖2)，表明所建文庫質(zhì)量較高。

圖1 LD-PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis pattern of LD-PCR product. 1: ds cDNA; M: Trans 2K plus DNA marker.

圖2 24個隨機(jī)克隆PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR products from 24 random clones. 1?24: 24 clones; M: Trans 2K plus DNA marker as in Fig. 1.

2.2 文庫測序及序列分析

利用大腸桿菌環(huán)化菌株BM25.8將原始文庫進(jìn)行環(huán)化，隨機(jī)挑取部分單克隆進(jìn)行菌液 PCR檢測，得到3 000個陽性克隆并進(jìn)行了5′端測序。共獲得2 607條大于100 bp的有效序列，經(jīng)組裝得到327個Contig和1 123個Singleton，合計1 450個Unigene。其長度介于133~1 480 bp，平均為675 bp。這些Unigene中有1 123個 (占總數(shù)77.5%) 在文庫中只出現(xiàn)1次，324個 (占總數(shù)22.3%) 出現(xiàn)2~38次，3個 (占總數(shù)0.2%)重復(fù)頻次很高，分別出現(xiàn)61、88和112次。文庫的冗余度為44.4%。

為了分析Unigene可能的生物學(xué)功能，將其在Nt、Nr和Swissprot等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中919條 (占總數(shù)63.4%) 與已知或推測功能的基因具有同源性，354條 (占總數(shù)24.4%) 具有功能未知的同源序列，其余177條 (占總數(shù)12.2%) 未獲得任何序列信息。后兩類基因合計531條 (占總數(shù)36.6%)，代表著新基因。與數(shù)據(jù)庫中沙冬青序列具有同源性或?qū)儆谕晦D(zhuǎn)錄本的Unigene序列只有13條。在可進(jìn)行功能注釋的Unigene中有不少與逆境應(yīng)答相關(guān)，包括脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶、鈣離子結(jié)合蛋白、抗氧化酶類、乙烯合成酶類、脯氨酸合成酶類、脫水保護(hù)蛋白、熱激蛋白、冷誘導(dǎo)蛋白、水孔蛋白、泛素及其連接酶、胰蛋白酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶和金屬硫蛋白(Metallothionein，MT) 等編碼基因，其中最后3種基因的EST出現(xiàn)頻率很高，均在60次以上。

采用GO功能分類方法可將Unigene分為3大類，即細(xì)胞組分、生物學(xué)過程和分子功能，分別包含265、452和566個Unigene，占Unigene總數(shù)的18.3%、31.2%和39.0%，對應(yīng)于424、693和1 007 (總計2 124) 個GO分類。在3大功能類型中共包含20個亞類 (Terms)，其中與生理過程 (Physiological process)、細(xì)胞過程 (Cellular process)、結(jié)合 (Binding)、催化活性 (Catalytic activity) 和細(xì)胞 (Cell) 相關(guān)的基因所占比例最大 (占總數(shù) 16.4%~27.2%)，其次是與細(xì)胞器(Organelle)、蛋白復(fù)合體 (Protein complex)、運(yùn)輸活性 (Transporter activity) 和結(jié)構(gòu)分子活性(Structure molecule activity) 相關(guān)的基因 (占總數(shù) 5.2%~10.2%)，與刺激應(yīng)答 (Response to stimulus)、基因表達(dá)調(diào)節(jié) (Transcription and translation regulator activities)、生理生化調(diào)節(jié)(Regulation of biological process and enzyme regulator activity)、胞外區(qū)域 (Extracellular region) 和信號轉(zhuǎn)導(dǎo) (Signal transducer activity)相關(guān)的基因也占相當(dāng)比例 (占總數(shù)0.6%~3.0%)，與發(fā)育 (Development)、抗氧化 (Antioxidant activity)、細(xì)胞運(yùn)動 (Motor activity) 和營養(yǎng)庫(Nutrient reservoir activity) 相關(guān)的基因最少 (占總數(shù)0.1%~0.5%）(圖3)。

2.3 部分抗逆相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了了解文庫中的抗逆相關(guān)基因是否參與蒙古沙冬青對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，用半定量RT-PCR方法分析了其中6個基因在干燥脫水過程中的表達(dá)變化。結(jié)果表明，除AmEREBP基因在處理1 h和8 h有一定程度的表達(dá)下調(diào)外，其余5個基因的表達(dá)水平在處理1~3 h后均有明顯上調(diào)，尤其以AmTI和AmDHN上調(diào)幅度最大，并一直持續(xù)到處理結(jié)束 (24 h)；AmCaM在處理24 h后表達(dá)量回落到接近對照水平；AmDREB在處理8~24 h后仍保持較高的表達(dá)量；而AmCAT在處理8~24 h后表達(dá)量有所降低，但仍明顯高于對照水平 (圖4)。這表明這些基因都不同程度地參與了蒙古沙冬青對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，其具體的功能驗證正在進(jìn)行之中。

圖3 Unigenes的GO功能分類與分布圖Fig.3 Map of GO functional classification and distribution of the Unigenes. Any given sequence may have been assigned to more than one category. The Unigene number and percentage in each GO term were shown in the brackets.

圖4 部分抗逆相關(guān)基因在干旱脅迫下的表達(dá)變化Fig. 4 Expression profiles of some stress-resistant related genes under drought stress.

3 討論

SMART技術(shù)因具有操作簡單和全長比例較高等優(yōu)點(diǎn)，在全長cDNA文庫的構(gòu)建中得到廣泛應(yīng)用。本文應(yīng)用該技術(shù)構(gòu)建了蒙古沙冬青在干旱脅迫下的全長cDNA文庫，其滴度和重組率分別高達(dá)1.6×107PFU/mL和97.7%，插入片段長度多數(shù)接近和超過1 kb，符合高質(zhì)量cDNA文庫的標(biāo)準(zhǔn)。從文庫中隨機(jī)挑選3 000個陽性克隆進(jìn)行了 5′端測序和序列分析，共獲得 1 450個Unigene，其中與抗逆相關(guān)的基因和功能未知的新基因至少占40%以上，為規(guī)?；Y選和鑒定蒙古沙冬青抗旱基因和探討其抗旱性分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

植物抗旱基因可分為調(diào)節(jié)基因和功能基因兩大類，通常在遭受干旱脅迫時，先是抗旱調(diào)節(jié)基因被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，然后通過一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將脅迫信號向下游傳遞，最終激活抗旱功能基因表達(dá)，使植物通過多種機(jī)制產(chǎn)生適應(yīng)或抗性[13]。已知的抗旱調(diào)節(jié)基因主要編碼bZIP、MYB、MYC和DREB類轉(zhuǎn)錄因子以及參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)或酶，而抗旱功能基因主要編碼滲透調(diào)節(jié)與脫水保護(hù)和抗氧化類物質(zhì)或者其合成酶類，以及在錯誤和損傷的修復(fù)、代謝途徑與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變等過程中起直接作用的蛋白質(zhì)或酶。在我們構(gòu)建的文庫中出現(xiàn)多個與抗旱調(diào)節(jié)基因同源的Unigene序列，如DREB和MYB等可激活重要抗旱功能基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、磷脂酶C (Phospholipase C，PLC) 等與第二信使產(chǎn)生相關(guān)的酶、CaM 和鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK) 等Ca2+信號傳感蛋白、有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK) 和2C類蛋白磷酸酶 (Protein phosphatase type 2C，PP2C) 等參與信號級聯(lián)傳遞的蛋白激酶和蛋白磷酸酶等編碼序列。在文庫中出現(xiàn)更多的是抗旱功能基因的同源序列，其中包括重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸合成的關(guān)鍵酶△`-吡咯啉-5-羧酸合成酶 (Delta`-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)、脫水保護(hù)性蛋白DHN和胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白 (Late embryogenesis-abundant protein，LEA)、抗氧化酶類超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase，SOD) 和CAT、與蛋白質(zhì)修復(fù)和降解有關(guān)的熱激蛋白 (Heat shock protein，HSP) 和泛素-蛋白連接酶 (Ubiquitin-protein ligase，UPL)、以及參與細(xì)胞壁木質(zhì)化而減少水分散失的 S-腺苷甲硫氨酸合成酶 (S-adenosylmethionine synthetase，SAMS) 等編碼基因。這些基因可能是構(gòu)成蒙古沙冬青強(qiáng)抗旱性的重要遺傳基礎(chǔ)。

乙烯作為一種脅迫應(yīng)答激素和次級信號分子，在植物響應(yīng)淹水、干旱和低溫等逆境中起重要作用。目前對其生化合成和信號傳遞的分子機(jī)制已比較清楚，其中氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶 (1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid/ACC synthase，ACS) 和氧化酶 (ACC Oxidase，ACO) 是乙烯生化合成中的兩種關(guān)鍵酶[14]。在我們構(gòu)建的文庫中出現(xiàn)1個ACS和3個ACO (ACO1、ACO2和ACO3) 的同源基因，此外還有 1個乙烯超形成蛋白 (Ethylene-overproduction protein) 和2個乙烯 應(yīng) 答 轉(zhuǎn) 錄 因 子 (Ethylene-responsive transcription factor，ERTF) 的編碼序列，而很少有脫落酸 (Abscisic acid，ABA) 等其他脅迫應(yīng)答激素合成與信號途徑的相關(guān)基因，表明乙烯信號途徑可能在蒙古沙冬青適應(yīng)干旱等逆境中起重要作用。

金屬硫蛋白MT是生物體內(nèi)廣泛存在的一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，具有強(qiáng)抗熱和抗蛋白酶消化等特性，在重金屬解毒、脅迫應(yīng)答和細(xì)胞增殖與凋亡等活動中有重要功能，特別是其清除活性氧自由基的能力很強(qiáng)，在抗輻射、抗氧化和抗衰老方面有特殊作用，已成為近年來的一個研究熱點(diǎn)[15]。寒冷、高溫和機(jī)械損傷等均可誘導(dǎo)MT基因表達(dá)及其蛋白的積累。將MT基因轉(zhuǎn)入煙草可提高其抗氧化酶類的活性和耐鹽性[16]。在我們構(gòu)建的文庫中共含有165個編碼MT (以MT2為主) 和類MT基因的EST序列，這是全部Unigene中EST出現(xiàn)頻率最高的一類。推測大量的MT可能有助于清除蒙古沙冬青在干熱逆境下產(chǎn)生的活性氧自由基，從而減輕其對核酸等生物大分子和膜系統(tǒng)的損傷。由于MT具有強(qiáng)抗熱和抗蛋白酶降解等特性，它們也可能作為一種抗干熱保護(hù)劑而對細(xì)胞起直接的保護(hù)作用。

幾丁質(zhì)酶是一類糖苷酶，在植物中可分為Ⅰ~Ⅶ類。它們可催化水解真菌和細(xì)菌細(xì)胞壁的重要成分，從而起到抑制病原菌生長和增殖的作用。將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物可提高其抗病性。因此，普遍認(rèn)為這類酶主要在植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮功能[17-18]。然而近年來發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶在植物抵抗干旱、寒冷、高鹽和紫外輻射等逆境中也起重要作用，有些幾丁質(zhì)酶行使抗凍蛋白的功能，有些則具有熱穩(wěn)定性[18-20]。在我們構(gòu)建的文庫中出現(xiàn)編碼Ⅰ類、Ⅲ類和Ⅴ類幾丁質(zhì)酶及類幾丁質(zhì)蛋白的Unigene序列，其中僅Ⅲ類幾丁質(zhì)酶基因的EST就出現(xiàn)58次。這表明幾丁質(zhì)酶可能在蒙古沙冬青抵抗干旱和冷凍等逆境中起重要作用，推測在其抵抗生物和非生物逆境中可能存在某些共同的分子機(jī)制。

植物抗旱性是由多基因多途徑調(diào)控的復(fù)雜性狀，本文對部分抗逆相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。我們認(rèn)為在蒙古沙冬青抵抗干旱等逆境的分子機(jī)制中不可能僅包含上述基因和信號途徑，在本文獲得的Unigene中還有531條(占總數(shù)36.6%) 功能未知，這些新基因以及上述具有已知或推測功能的同源基因在抗旱性中的作用尚待進(jìn)一步鑒定。在后續(xù)研究中我們將對文庫進(jìn)行表達(dá)譜分析，擬篩選和克隆一批候選抗逆基因進(jìn)行功能驗證。

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