茶尺蠖核型多角體病毒多角體蛋白單克隆抗體的制備

杜軍利，張傳溪，付建玉，陳正賢，肖強(qiáng)

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

2 浙江大學(xué)昆蟲(chóng)科學(xué)研究所，浙江 杭州 310058

3 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

茶尺蠖Ectropis obliqua Prout屬鱗翅目尺蛾科，是我國(guó)主要茶樹(shù)害蟲(chóng)之一，廣泛分布于長(zhǎng)江中下游茶區(qū)，其中浙江、江蘇、安徽3省發(fā)生尤為嚴(yán)重。其幼蟲(chóng)咬食嫩葉和芽頭，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)常將整片茶園茶樹(shù)啃成光桿，對(duì)茶葉生產(chǎn)影響大。

茶尺蠖核型多角體病毒 (Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV) 于1977年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)[1]，屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬。EoNPV是自然條件下控制茶尺蠖種群的主要病原性天敵因子，它通過(guò)幼蟲(chóng)取食后侵入蟲(chóng)體并迅速增殖，使其感染發(fā)病而死亡，進(jìn)而在種群中造成病毒流行病。我國(guó)較早開(kāi)展了EoNPV的生物學(xué)及應(yīng)用基礎(chǔ)研究，目前該病毒制劑已獲批農(nóng)藥登記許可，廣泛應(yīng)用于浙江省及周邊省區(qū)茶園。傳統(tǒng)的EoNPV的檢測(cè)依賴(lài)LT50和LC50兩個(gè)生物測(cè)定參數(shù)；作者前期研究利用熒光定量 PCR方法測(cè)定茶尺蠖核型多角體病毒拷貝數(shù)，為病毒的深入研究和病毒制劑的定量檢測(cè)提供了方法依據(jù)[2]；進(jìn)一步研究建立快速定性、定量檢測(cè)EoNPV的技術(shù)對(duì)茶園昆蟲(chóng)病毒研發(fā)與大面積推廣應(yīng)用具有重要的作用。本研究通過(guò)制備獲得EoNPV的單克隆抗體，該抗體能特異地與EoNPV病毒粒子蛋白結(jié)合，并建立了基于此單抗的ELISA檢測(cè)方法，從而為EoNPV的準(zhǔn)確快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠及其飼料購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué)；茶尺蠖野生型種群采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉所試驗(yàn)茶園，并經(jīng)室內(nèi)繼代飼養(yǎng)；茶尺蠖核型多角體病毒 (EoNPV) 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所保存。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過(guò)氧物酶標(biāo)記的山羊抗鼠為 Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640、HAT、HT培養(yǎng)基、PEG6000購(gòu)自Gibco公司；牛血清蛋白 (BSA) 購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0引自浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，用高糖的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2 EoNPV病毒粒子的分離純化

收集感染EoNPV而死亡的茶尺蠖幼蟲(chóng)作為試蟲(chóng)，將其磨碎；用5層粗棉布過(guò)濾其中較大顆粒后，反復(fù)3 000~5 000 r/min離心，用1×PBS反復(fù)洗滌純化的多角體，至乳白色為止；加入適量新配制的裂解液0.1 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaCl (pH 10.3) 裂解多角體1~2 h；用50%的HCl中和堿液，3 000 r/min離心5 min，去除其中未裂解的多角體；在160 000 r/min、1.5 h超速離心，沉淀EoNPV病毒粒子；使用PBS懸浮純化的病毒粒子，存于4 ℃冰箱待用[3-4]。

1.3 小鼠免疫

將經(jīng)超速離心純化后的茶尺蠖核型多角體病毒粒子作為抗原與等量福氏完全佐劑充分混合，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，每只200 μL，間隔14 d用含等量的福氏不完全佐劑的蛋白抗原相同劑量作第2、3次免疫，14 d后，腹腔注射不加佐劑的蛋白抗原，每只200 μL，3 d后取脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合[5-7]。

1.4 細(xì)胞融合和克隆

在加強(qiáng)免疫后3 d左右獲取小鼠脾細(xì)胞，將其與正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，每次融合后，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，用含HAT的1640完全培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)10 d左右，然后將HAT改為HT培養(yǎng)1周[8-9]。待細(xì)胞長(zhǎng)至顯微鏡視野的1/4，取培養(yǎng)上清用ELISA法檢測(cè)抗體，將原免疫用抗原 EoNPV病毒粒子稀釋100倍作為包被抗原[10-11]，使用間接 ELISA方法檢測(cè)獲得陽(yáng)性細(xì)胞；再以陰性對(duì)照 (包括 Bt生物制劑、菜青蟲(chóng)顆粒體病毒) 作為包被抗原對(duì)所選陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行再篩選，最終獲得的陽(yáng)性細(xì)胞株只對(duì) EoNPV病毒多角體蛋白表現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；選擇最終的陽(yáng)性細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行克隆[12-14]。

1.5 陽(yáng)性單克隆抗體細(xì)胞株的篩選

對(duì)克隆后檢測(cè)為陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行規(guī)律傳代培養(yǎng)，并且每一代檢測(cè)它們的抗體分泌情況，最終獲得穩(wěn)定分泌抗體的EoNPV單克隆抗體細(xì)胞株。

1.6 小鼠腹水抗體制備及效價(jià)測(cè)定

將最后篩選出的陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并向小鼠腹部注射降植烷。1周后，使用生理鹽水將細(xì)胞沉淀懸浮，接種于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明顯鼓脹，抽取腹水測(cè)定其抗體效價(jià)并保存于?20 ℃，用于檢測(cè)[15]。

培養(yǎng)上清或腹水經(jīng)稀釋后，加到包被原包被的酶標(biāo)板中，孵育、洗滌后，再加入 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，底物顯色。陽(yáng)性對(duì)照為小鼠陽(yáng)性血清，同時(shí)分別以同等稀釋的Sp2/0培養(yǎng)上清，或無(wú)免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，空白對(duì)照為PBS[16]。

1.7 單抗的穩(wěn)定性

將分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)傳代，或置液氮中凍存 3個(gè)月后復(fù)蘇，用間接 ELISA方法檢查該細(xì)胞株分泌單抗的穩(wěn)定性[17]。

1.8 ph基因的克隆與原核表達(dá)

根據(jù) EoNPV 基因組序列 (GenBank Accession No. NC_008586.1) 的ph基因[18-21]，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，EoNPV ph F：5'-GGATCCatgtatactcgttaca-3'和 EoNPV ph R：5'-CTCGAGttaatacgcaggtcct-3'，擴(kuò)增ph基因，PCR反應(yīng)采用25 μL體系，PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，預(yù)測(cè)片段大小約741 bp。

擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆至pMD18-T克隆載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-4T2，提取質(zhì)粒并通過(guò) PCR鑒定，最后得到與谷胱甘肽融合表達(dá)的載體質(zhì)粒pGEX- 4T-2-ph。

將 pGEX-4T-2-ph轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株 E. coli BL21 (DE3) 中表達(dá)，挑取單菌落于37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日轉(zhuǎn)接5%培養(yǎng)液于新鮮5 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6 (2~3 h)，加入IPTG，37 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5~8 h，分別收集菌體，用適量PBS稀釋后，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴5 min后，12 000 r/min離心10 min去除不溶物，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)及Western blotting分析。同時(shí)，以BL21菌液和轉(zhuǎn)化pGEX-4T2的誘導(dǎo)菌液作為對(duì)照。

1.9 Western blotting分析

多角體蛋白 (Polyhedrin，PH)、EoNPV病毒粒子、PGEX-4T-2載體蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，分離膠及與膠相同大小的PVDF膜和3層濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)移緩沖液中平衡15~20 min；將3層濾紙、分離膠、PVDF膜和3層濾紙依次裝入轉(zhuǎn)移夾中，以Bio-Rad轉(zhuǎn)印槽半干轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移條件為恒電壓15V 15 min；PVDF膜用封閉液 (4%脫脂奶粉) 室溫封閉 1 h；加入小鼠腹水于洗滌液中稀釋1 000倍，室溫反應(yīng)1 h或4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；PBST洗滌3~5次，每次5 min；HRP酶標(biāo)的羊抗鼠二抗于洗滌液中室溫反應(yīng)1 h；洗滌3~5次，每次5 min；加入10 mL HRP反應(yīng)底物DAB溶液覆蓋于PVDF膜上顯色，待陽(yáng)性條帶顯示后，用ddH2O終止反應(yīng)[22-24]。

1.10 最適工作濃度的確定

把濃度為1.5 g/L的純化病毒從1∶100開(kāi)始依次倍比稀釋?zhuān)♂屩?∶204 800。由左至右依次加入96孔板，置于4℃包被過(guò)夜或者37 ℃包被2 h。使用間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)需加入一抗時(shí)，將單克隆抗體從1∶1 500開(kāi)始依次倍比稀釋?zhuān)♂屩?1∶192 000，由上而下依次加入 96孔板。顯色后置于酶標(biāo)儀上讀板[25-26]。

1.11 檢測(cè)靈敏度的測(cè)定

感染EoNPV的蟲(chóng)體汁液按1∶10~1∶327 680倍比稀釋?zhuān)鸭兓蟮腅oNPV病毒粒子 (1.5 g/L)使用包被液從1∶10~1∶5 120倍比稀釋后，分別作為抗原，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并以未感染病毒的茶尺蠖蟲(chóng)體汁液作為陰性對(duì)照。再將上述稀釋液加入反應(yīng)孔中，4 ℃包被過(guò)夜，使用間接ELISA方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)[27-28]。

1.12 樣品檢測(cè)

獲取涂抹EoNPV的葉片飼喂的茶尺蠖和健康葉片飼喂茶尺蠖各 30頭，稱(chēng)取蟲(chóng)體重量。磨碎后，根據(jù)體重分別稀釋10倍，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。用提純的EoNPV作陽(yáng)性對(duì)照，包被液作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立

雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的間接 ELISA的檢測(cè)結(jié)果表明：以細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)EoNPV抗原OD492值，與正常BALB/c小鼠血清對(duì)EoNPV抗原的OD450值之比大于 2.1，且雜交瘤細(xì)胞上清對(duì) Bt的檢測(cè)結(jié)果為陰性，判為陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過(guò)篩選和有限稀釋法亞克隆，獲得了1株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，命名為7D3。

2.2 單抗的穩(wěn)定性

經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代凍存2個(gè)月后，將雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇，該細(xì)胞株仍能分泌抗體，間接 ELISA檢測(cè)效價(jià)和原來(lái)效價(jià)無(wú)差別，表明該雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性較好。

2.3 雜交瘤細(xì)胞腹水效價(jià)測(cè)定

把雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)入小鼠腹部后，獲得該雜交瘤細(xì)胞的腹水。腹水先稀釋100倍，而后再依次倍比系列稀釋?zhuān)詈笫褂瞄g接 ELISA法測(cè)定OD450值，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性陰性血清對(duì)照。雜交瘤細(xì)胞腹水的OD450值之比大于2.1時(shí)的最大稀釋度即為其 ELISA效價(jià)，經(jīng)檢測(cè)得知該雜交瘤細(xì)胞的效價(jià)為106(圖1)。

圖1 細(xì)胞株7D3的抗體效價(jià)測(cè)定Fig. 1 The titres of ascitic of cell line 7D3.

2.4 用制備的單抗對(duì)病毒進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)

把EoNPV進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用制備的單抗為一抗，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示，在約28 kDa處有強(qiáng)陽(yáng)性條帶(圖2)，與SDS-PAGE上出現(xiàn)的多角體蛋白條帶大小相近，推測(cè)所獲得的單抗應(yīng)是一種多角體蛋白 (PH蛋白) 單抗。

2.5 ph基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為了確認(rèn)獲得的單抗是一種多角體蛋白單抗，進(jìn)一步克隆表達(dá)多角體蛋白基因ph。首先用引物ph F、ph R從EoNPV基因組DNA中擴(kuò)增出長(zhǎng)度741 bp的ph基因，連接至pMD18-T克隆載體，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，回收片段，將其定向克隆至由 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切過(guò)的 pGEX-4T-2載體，PCR鑒定，結(jié)果顯示獲得表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-ph (圖3)。

圖2 EoNPV的Western blotting分析Fig. 2 Western blotting analysis of EoNPV. M: protein marker; 1: virus of EoNPV.

圖3 ph基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 3 Construction of ph gene prokaryotic expression-vector plasmid. 1: PCR product of ph gene; 2: recombinant pMD18-T vector was identified by double enzyme digestion with BamH I and Xho I; 3: pGEX-4T-2-ph was identified by PCR.

2.6 ph基因的表達(dá)和Western blotting分析

表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-2-ph轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明，大約54 kDa處有明顯的特異性條帶 (圖4)，與GST和polyhedrin融合表達(dá)產(chǎn)物大小相符。然后使用已制備的EoNPV的單抗進(jìn)行 Western blotting分析，發(fā)現(xiàn)該抗體與EoNPV病毒粒子和 ph基因原核表達(dá)蛋白均有特異性條帶，而且蛋白大小與預(yù)期一致，同時(shí)顯示陽(yáng)性的還有一條分子量約為 40 kDa的條帶，可能是ph基因不完全表達(dá)產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物的降解產(chǎn)物。而作為陰性對(duì)照的空 PGEX-4T-2載體表達(dá)產(chǎn)物與雜交瘤細(xì)胞的腹水無(wú)明顯的條帶出現(xiàn) (圖4)。

2.7 工作濃度的確定

檢測(cè)用的EoNPV單抗腹水倍比稀釋后進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，單抗在1∶192 000范圍內(nèi)均可用于檢測(cè)，與在此范圍內(nèi)的陰性對(duì)照的OD值非常低，P/N值大于＞8，但是在實(shí)際應(yīng)用時(shí)要求有較高的靈敏度，因此我們選擇單抗腹水稀釋倍數(shù)為1∶6 000作為間接ELISA的最適工作濃度，另外二抗的最適濃度為1∶5 000。

2.8 檢測(cè)靈敏度的確定

把感染病毒的病蟲(chóng)體液倍比稀釋后經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，從1∶10到1∶20 480都是較理想的稀釋度，當(dāng)稀釋度為1∶10 240時(shí)，P/N＜2.1，所以其檢測(cè)極限為1∶5 120。純化后的EoNPV粒子 (1.5 g/L) 及未感染的茶尺蠖蟲(chóng)體液倍比稀釋后，進(jìn)行間接 ELISA檢測(cè)，7D3細(xì)胞株所得單抗對(duì)純化的EoNPV粒子有較高的靈敏度，靈敏度可達(dá)到6 ng (圖5)。由此可建立了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=?0.4144x+3.0742 (R2=0.9929，圖6)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算未知樣品的稀釋倍數(shù) x，病毒濃度 (g/L) 即為1.5÷ (2x×100)。一般實(shí)驗(yàn)中都以多角體個(gè)數(shù)為病毒的單位，即 PIB/mL，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知多角體數(shù)量與g/L的換算關(guān)系為1 g/L=2.75×108PIB/mL。因此在使用圖6所示公式計(jì)算出病毒的濃度后，再換算成多角體個(gè)數(shù)。

圖4 SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE and Western blotting analysis. M: protein molecular weight marker; 1,2: SDS-PAGE analysis of ph protein, PGEX-4T-2 vector, respectively; 3,4: Western blotting analysis of GST-ph fusion protein, PGEX-4T-2 vector, respectively.

圖5 細(xì)胞株7D3對(duì)純病毒的檢測(cè)Fig. 5 Detection of the purified EoNPV with cell line 7D3.

圖6 不同濃度梯度的純化病毒OD450值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 6 Standard curve of OD450 value with different concentration of purified EoNPV.

2.9 樣品檢測(cè)

通過(guò)間接ELISA檢測(cè)得知，使用EoNPV的葉片飼喂的茶尺蠖檢測(cè)率為100%，另外用血清計(jì)數(shù)法對(duì)其進(jìn)行觀察，表明飼喂EoNPV的葉片的茶尺蠖體內(nèi)確含有EoNPV病毒，而飼喂健康葉片的茶尺蠖檢測(cè)率為0，使用血清計(jì)數(shù)法檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)EoNPV的多角體。因此間接ELISA方法與血清計(jì)數(shù)法檢出陽(yáng)性率一致。

3 討論

單克隆抗體技術(shù)是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域中一次重大技術(shù)突破，雜交瘤細(xì)胞既具有大量無(wú)限生長(zhǎng)的特性，又具有合成和分泌抗體的能力，是由識(shí)別單一抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體。與常規(guī)多克隆抗體相比，由雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高、質(zhì)地均一，可以大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此在近20年內(nèi)得到了快速地發(fā)展，而且在生物科學(xué)的許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但是用雜交瘤技術(shù)制備單抗耗時(shí)長(zhǎng)，成本也較高，又難獲得對(duì)某些半抗原和抗原的抗體，因而阻礙了單抗技術(shù)應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。在植?？蒲蓄I(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外先后研制出多種植物病毒、真菌、細(xì)菌和昆蟲(chóng)病毒等病原微生物的單克隆抗體，并初步開(kāi)始相關(guān)的應(yīng)用研究，突顯出其廣闊的應(yīng)用前景[29]。1982年德國(guó)的Robert等首次研制出5株分泌抗苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒 (AcNPV) 單抗雜交瘤細(xì)胞株[30]，接著加拿大的Hohman等研制出34株抗AcNPV單克隆抗體[31]。隨后10年來(lái)，相繼研發(fā)出一些昆蟲(chóng)病毒單克隆抗體。雖然與其他動(dòng)物病毒相比，昆蟲(chóng)病毒單克隆抗體應(yīng)用研究起步比較晚，但已初步顯示出廣泛的應(yīng)用前景，因此研制昆蟲(chóng)病毒單克隆抗體診斷試劑逐漸取代常規(guī)的抗血清已成為大勢(shì)所趨。

單抗的專(zhuān)一性與選用的抗原有密切的關(guān)系，在NPV中多角體蛋白量最大，制備方便，抗原性也很強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，利用細(xì)胞融合技術(shù)制備了能穩(wěn)定分泌抗EoNPV多角體蛋白的雜交瘤細(xì)胞株 (7D3)，該細(xì)胞株靈敏度較高，效價(jià)為105，能夠檢測(cè)EoNPV生物制劑中是否含有EoNPV的多角體，由此建立了快速檢測(cè)的 ELISA檢測(cè)方法。由于自然界存在許多種桿狀病毒，EoNPV多角體蛋白與其他多種NPV的多角體基因同源性比較高[3]，例如茶刺蛾核型多角體病毒、茶毛蟲(chóng)核型多角體病毒、家蠶核型多角體病毒等桿狀病毒等，所制備的抗體可能對(duì)含有多角體蛋白的其它桿狀病毒也能特異性結(jié)合，因此有必要作進(jìn)一步研究，以明確目前所篩選出的是否是只對(duì)EoNPV專(zhuān)一性結(jié)合的單克隆抗體，進(jìn)而建立更加完善的定性定量檢測(cè)EoNPV的方法。

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