茶尺蠖核型多角體病毒多角體蛋白單克隆抗體的制備

杜軍利，張傳溪，付建玉，陳正賢，肖強(qiáng)

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

2 浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所，浙江 杭州 310058

3 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

茶尺蠖Ectropis obliqua Prout屬鱗翅目尺蛾科，是我國主要茶樹害蟲之一，廣泛分布于長江中下游茶區(qū)，其中浙江、江蘇、安徽3省發(fā)生尤為嚴(yán)重。其幼蟲咬食嫩葉和芽頭，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)常將整片茶園茶樹啃成光桿，對茶葉生產(chǎn)影響大。

茶尺蠖核型多角體病毒 (Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV) 于1977年在我國首次發(fā)現(xiàn)[1]，屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬。EoNPV是自然條件下控制茶尺蠖種群的主要病原性天敵因子，它通過幼蟲取食后侵入蟲體并迅速增殖，使其感染發(fā)病而死亡，進(jìn)而在種群中造成病毒流行病。我國較早開展了EoNPV的生物學(xué)及應(yīng)用基礎(chǔ)研究，目前該病毒制劑已獲批農(nóng)藥登記許可，廣泛應(yīng)用于浙江省及周邊省區(qū)茶園。傳統(tǒng)的EoNPV的檢測依賴LT50和LC50兩個(gè)生物測定參數(shù)；作者前期研究利用熒光定量 PCR方法測定茶尺蠖核型多角體病毒拷貝數(shù)，為病毒的深入研究和病毒制劑的定量檢測提供了方法依據(jù)[2]；進(jìn)一步研究建立快速定性、定量檢測EoNPV的技術(shù)對茶園昆蟲病毒研發(fā)與大面積推廣應(yīng)用具有重要的作用。本研究通過制備獲得EoNPV的單克隆抗體，該抗體能特異地與EoNPV病毒粒子蛋白結(jié)合，并建立了基于此單抗的ELISA檢測方法，從而為EoNPV的準(zhǔn)確快速檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠及其飼料購自上海醫(yī)科大學(xué)；茶尺蠖野生型種群采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉所試驗(yàn)茶園，并經(jīng)室內(nèi)繼代飼養(yǎng)；茶尺蠖核型多角體病毒 (EoNPV) 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所保存。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧物酶標(biāo)記的山羊抗鼠為 Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640、HAT、HT培養(yǎng)基、PEG6000購自Gibco公司；牛血清蛋白 (BSA) 購自杭州四季青生物工程材料有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0引自浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，用高糖的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2 EoNPV病毒粒子的分離純化

收集感染EoNPV而死亡的茶尺蠖幼蟲作為試蟲，將其磨碎；用5層粗棉布過濾其中較大顆粒后，反復(fù)3 000~5 000 r/min離心，用1×PBS反復(fù)洗滌純化的多角體，至乳白色為止；加入適量新配制的裂解液0.1 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaCl (pH 10.3) 裂解多角體1~2 h；用50%的HCl中和堿液，3 000 r/min離心5 min，去除其中未裂解的多角體；在160 000 r/min、1.5 h超速離心，沉淀EoNPV病毒粒子；使用PBS懸浮純化的病毒粒子，存于4 ℃冰箱待用[3-4]。

1.3 小鼠免疫

將經(jīng)超速離心純化后的茶尺蠖核型多角體病毒粒子作為抗原與等量福氏完全佐劑充分混合，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，每只200 μL，間隔14 d用含等量的福氏不完全佐劑的蛋白抗原相同劑量作第2、3次免疫，14 d后，腹腔注射不加佐劑的蛋白抗原，每只200 μL，3 d后取脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合[5-7]。

1.4 細(xì)胞融合和克隆

在加強(qiáng)免疫后3 d左右獲取小鼠脾細(xì)胞，將其與正處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，每次融合后，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，用含HAT的1640完全培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)10 d左右，然后將HAT改為HT培養(yǎng)1周[8-9]。待細(xì)胞長至顯微鏡視野的1/4，取培養(yǎng)上清用ELISA法檢測抗體，將原免疫用抗原 EoNPV病毒粒子稀釋100倍作為包被抗原[10-11]，使用間接 ELISA方法檢測獲得陽性細(xì)胞；再以陰性對照 (包括 Bt生物制劑、菜青蟲顆粒體病毒) 作為包被抗原對所選陽性細(xì)胞進(jìn)行再篩選，最終獲得的陽性細(xì)胞株只對 EoNPV病毒多角體蛋白表現(xiàn)陽性反應(yīng)；選擇最終的陽性細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行克隆[12-14]。

1.5 陽性單克隆抗體細(xì)胞株的篩選

對克隆后檢測為陽性的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行規(guī)律傳代培養(yǎng)，并且每一代檢測它們的抗體分泌情況，最終獲得穩(wěn)定分泌抗體的EoNPV單克隆抗體細(xì)胞株。

1.6 小鼠腹水抗體制備及效價(jià)測定

將最后篩選出的陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并向小鼠腹部注射降植烷。1周后，使用生理鹽水將細(xì)胞沉淀懸浮，接種于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明顯鼓脹，抽取腹水測定其抗體效價(jià)并保存于?20 ℃，用于檢測[15]。

培養(yǎng)上清或腹水經(jīng)稀釋后，加到包被原包被的酶標(biāo)板中，孵育、洗滌后，再加入 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，底物顯色。陽性對照為小鼠陽性血清，同時(shí)分別以同等稀釋的Sp2/0培養(yǎng)上清，或無免疫小鼠血清為陰性對照，空白對照為PBS[16]。

1.7 單抗的穩(wěn)定性

將分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)傳代，或置液氮中凍存 3個(gè)月后復(fù)蘇，用間接 ELISA方法檢查該細(xì)胞株分泌單抗的穩(wěn)定性[17]。

1.8 ph基因的克隆與原核表達(dá)

根據(jù) EoNPV 基因組序列 (GenBank Accession No. NC_008586.1) 的ph基因[18-21]，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，EoNPV ph F：5'-GGATCCatgtatactcgttaca-3'和 EoNPV ph R：5'-CTCGAGttaatacgcaggtcct-3'，擴(kuò)增ph基因，PCR反應(yīng)采用25 μL體系，PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，預(yù)測片段大小約741 bp。

擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆至pMD18-T克隆載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-4T2，提取質(zhì)粒并通過 PCR鑒定，最后得到與谷胱甘肽融合表達(dá)的載體質(zhì)粒pGEX- 4T-2-ph。

將 pGEX-4T-2-ph轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株 E. coli BL21 (DE3) 中表達(dá)，挑取單菌落于37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接5%培養(yǎng)液于新鮮5 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6 (2~3 h)，加入IPTG，37 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5~8 h，分別收集菌體，用適量PBS稀釋后，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴5 min后，12 000 r/min離心10 min去除不溶物，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測及Western blotting分析。同時(shí)，以BL21菌液和轉(zhuǎn)化pGEX-4T2的誘導(dǎo)菌液作為對照。

1.9 Western blotting分析

多角體蛋白 (Polyhedrin，PH)、EoNPV病毒粒子、PGEX-4T-2載體蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，分離膠及與膠相同大小的PVDF膜和3層濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)移緩沖液中平衡15~20 min；將3層濾紙、分離膠、PVDF膜和3層濾紙依次裝入轉(zhuǎn)移夾中，以Bio-Rad轉(zhuǎn)印槽半干轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移條件為恒電壓15V 15 min；PVDF膜用封閉液 (4%脫脂奶粉) 室溫封閉 1 h；加入小鼠腹水于洗滌液中稀釋1 000倍，室溫反應(yīng)1 h或4 ℃反應(yīng)過夜；PBST洗滌3~5次，每次5 min；HRP酶標(biāo)的羊抗鼠二抗于洗滌液中室溫反應(yīng)1 h；洗滌3~5次，每次5 min；加入10 mL HRP反應(yīng)底物DAB溶液覆蓋于PVDF膜上顯色，待陽性條帶顯示后，用ddH2O終止反應(yīng)[22-24]。

1.10 最適工作濃度的確定

把濃度為1.5 g/L的純化病毒從1∶100開始依次倍比稀釋，稀釋至1∶204 800。由左至右依次加入96孔板，置于4℃包被過夜或者37 ℃包被2 h。使用間接ELISA進(jìn)行檢測，當(dāng)需加入一抗時(shí)，將單克隆抗體從1∶1 500開始依次倍比稀釋，稀釋至 1∶192 000，由上而下依次加入 96孔板。顯色后置于酶標(biāo)儀上讀板[25-26]。

1.11 檢測靈敏度的測定

感染EoNPV的蟲體汁液按1∶10~1∶327 680倍比稀釋，把純化后的EoNPV病毒粒子 (1.5 g/L)使用包被液從1∶10~1∶5 120倍比稀釋后，分別作為抗原，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并以未感染病毒的茶尺蠖蟲體汁液作為陰性對照。再將上述稀釋液加入反應(yīng)孔中，4 ℃包被過夜，使用間接ELISA方法進(jìn)行靈敏度檢測[27-28]。

1.12 樣品檢測

獲取涂抹EoNPV的葉片飼喂的茶尺蠖和健康葉片飼喂茶尺蠖各 30頭，稱取蟲體重量。磨碎后，根據(jù)體重分別稀釋10倍，進(jìn)行ELISA檢測。用提純的EoNPV作陽性對照，包被液作陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立

雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的間接 ELISA的檢測結(jié)果表明：以細(xì)胞培養(yǎng)上清對EoNPV抗原OD492值，與正常BALB/c小鼠血清對EoNPV抗原的OD450值之比大于 2.1，且雜交瘤細(xì)胞上清對 Bt的檢測結(jié)果為陰性，判為陽性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過篩選和有限稀釋法亞克隆，獲得了1株陽性雜交瘤細(xì)胞，命名為7D3。

2.2 單抗的穩(wěn)定性

經(jīng)過連續(xù)傳代凍存2個(gè)月后，將雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇，該細(xì)胞株仍能分泌抗體，間接 ELISA檢測效價(jià)和原來效價(jià)無差別，表明該雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性較好。

2.3 雜交瘤細(xì)胞腹水效價(jià)測定

把雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)入小鼠腹部后，獲得該雜交瘤細(xì)胞的腹水。腹水先稀釋100倍，而后再依次倍比系列稀釋，最后使用間接 ELISA法測定OD450值，同時(shí)設(shè)立陽性陰性血清對照。雜交瘤細(xì)胞腹水的OD450值之比大于2.1時(shí)的最大稀釋度即為其 ELISA效價(jià)，經(jīng)檢測得知該雜交瘤細(xì)胞的效價(jià)為106(圖1)。

圖1 細(xì)胞株7D3的抗體效價(jià)測定Fig. 1 The titres of ascitic of cell line 7D3.

2.4 用制備的單抗對病毒進(jìn)行 Western blotting檢測

把EoNPV進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用制備的單抗為一抗，進(jìn)行Western blotting檢測。結(jié)果顯示，在約28 kDa處有強(qiáng)陽性條帶(圖2)，與SDS-PAGE上出現(xiàn)的多角體蛋白條帶大小相近，推測所獲得的單抗應(yīng)是一種多角體蛋白 (PH蛋白) 單抗。

2.5 ph基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為了確認(rèn)獲得的單抗是一種多角體蛋白單抗，進(jìn)一步克隆表達(dá)多角體蛋白基因ph。首先用引物ph F、ph R從EoNPV基因組DNA中擴(kuò)增出長度741 bp的ph基因，連接至pMD18-T克隆載體，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，回收片段，將其定向克隆至由 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切過的 pGEX-4T-2載體，PCR鑒定，結(jié)果顯示獲得表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-ph (圖3)。

圖2 EoNPV的Western blotting分析Fig. 2 Western blotting analysis of EoNPV. M: protein marker; 1: virus of EoNPV.

圖3 ph基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 3 Construction of ph gene prokaryotic expression-vector plasmid. 1: PCR product of ph gene; 2: recombinant pMD18-T vector was identified by double enzyme digestion with BamH I and Xho I; 3: pGEX-4T-2-ph was identified by PCR.

2.6 ph基因的表達(dá)和Western blotting分析

表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-2-ph轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明，大約54 kDa處有明顯的特異性條帶 (圖4)，與GST和polyhedrin融合表達(dá)產(chǎn)物大小相符。然后使用已制備的EoNPV的單抗進(jìn)行 Western blotting分析，發(fā)現(xiàn)該抗體與EoNPV病毒粒子和 ph基因原核表達(dá)蛋白均有特異性條帶，而且蛋白大小與預(yù)期一致，同時(shí)顯示陽性的還有一條分子量約為 40 kDa的條帶，可能是ph基因不完全表達(dá)產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物的降解產(chǎn)物。而作為陰性對照的空 PGEX-4T-2載體表達(dá)產(chǎn)物與雜交瘤細(xì)胞的腹水無明顯的條帶出現(xiàn) (圖4)。

2.7 工作濃度的確定

檢測用的EoNPV單抗腹水倍比稀釋后進(jìn)行間接ELISA檢測，單抗在1∶192 000范圍內(nèi)均可用于檢測，與在此范圍內(nèi)的陰性對照的OD值非常低，P/N值大于＞8，但是在實(shí)際應(yīng)用時(shí)要求有較高的靈敏度，因此我們選擇單抗腹水稀釋倍數(shù)為1∶6 000作為間接ELISA的最適工作濃度，另外二抗的最適濃度為1∶5 000。

2.8 檢測靈敏度的確定

把感染病毒的病蟲體液倍比稀釋后經(jīng)間接ELISA檢測，從1∶10到1∶20 480都是較理想的稀釋度，當(dāng)稀釋度為1∶10 240時(shí)，P/N＜2.1，所以其檢測極限為1∶5 120。純化后的EoNPV粒子 (1.5 g/L) 及未感染的茶尺蠖蟲體液倍比稀釋后，進(jìn)行間接 ELISA檢測，7D3細(xì)胞株所得單抗對純化的EoNPV粒子有較高的靈敏度，靈敏度可達(dá)到6 ng (圖5)。由此可建立了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=?0.4144x+3.0742 (R2=0.9929，圖6)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算未知樣品的稀釋倍數(shù) x，病毒濃度 (g/L) 即為1.5÷ (2x×100)。一般實(shí)驗(yàn)中都以多角體個(gè)數(shù)為病毒的單位，即 PIB/mL，通過實(shí)驗(yàn)得知多角體數(shù)量與g/L的換算關(guān)系為1 g/L=2.75×108PIB/mL。因此在使用圖6所示公式計(jì)算出病毒的濃度后，再換算成多角體個(gè)數(shù)。

圖4 SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE and Western blotting analysis. M: protein molecular weight marker; 1,2: SDS-PAGE analysis of ph protein, PGEX-4T-2 vector, respectively; 3,4: Western blotting analysis of GST-ph fusion protein, PGEX-4T-2 vector, respectively.

圖5 細(xì)胞株7D3對純病毒的檢測Fig. 5 Detection of the purified EoNPV with cell line 7D3.

圖6 不同濃度梯度的純化病毒OD450值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 6 Standard curve of OD450 value with different concentration of purified EoNPV.

2.9 樣品檢測

通過間接ELISA檢測得知，使用EoNPV的葉片飼喂的茶尺蠖檢測率為100%，另外用血清計(jì)數(shù)法對其進(jìn)行觀察，表明飼喂EoNPV的葉片的茶尺蠖體內(nèi)確含有EoNPV病毒，而飼喂健康葉片的茶尺蠖檢測率為0，使用血清計(jì)數(shù)法檢測未發(fā)現(xiàn)EoNPV的多角體。因此間接ELISA方法與血清計(jì)數(shù)法檢出陽性率一致。

3 討論

單克隆抗體技術(shù)是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域中一次重大技術(shù)突破，雜交瘤細(xì)胞既具有大量無限生長的特性，又具有合成和分泌抗體的能力，是由識別單一抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體。與常規(guī)多克隆抗體相比，由雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高、質(zhì)地均一，可以大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此在近20年內(nèi)得到了快速地發(fā)展，而且在生物科學(xué)的許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但是用雜交瘤技術(shù)制備單抗耗時(shí)長，成本也較高，又難獲得對某些半抗原和抗原的抗體，因而阻礙了單抗技術(shù)應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。在植保科研領(lǐng)域，國內(nèi)外先后研制出多種植物病毒、真菌、細(xì)菌和昆蟲病毒等病原微生物的單克隆抗體，并初步開始相關(guān)的應(yīng)用研究，突顯出其廣闊的應(yīng)用前景[29]。1982年德國的Robert等首次研制出5株分泌抗苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒 (AcNPV) 單抗雜交瘤細(xì)胞株[30]，接著加拿大的Hohman等研制出34株抗AcNPV單克隆抗體[31]。隨后10年來，相繼研發(fā)出一些昆蟲病毒單克隆抗體。雖然與其他動物病毒相比，昆蟲病毒單克隆抗體應(yīng)用研究起步比較晚，但已初步顯示出廣泛的應(yīng)用前景，因此研制昆蟲病毒單克隆抗體診斷試劑逐漸取代常規(guī)的抗血清已成為大勢所趨。

單抗的專一性與選用的抗原有密切的關(guān)系，在NPV中多角體蛋白量最大，制備方便，抗原性也很強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，利用細(xì)胞融合技術(shù)制備了能穩(wěn)定分泌抗EoNPV多角體蛋白的雜交瘤細(xì)胞株 (7D3)，該細(xì)胞株靈敏度較高，效價(jià)為105，能夠檢測EoNPV生物制劑中是否含有EoNPV的多角體，由此建立了快速檢測的 ELISA檢測方法。由于自然界存在許多種桿狀病毒，EoNPV多角體蛋白與其他多種NPV的多角體基因同源性比較高[3]，例如茶刺蛾核型多角體病毒、茶毛蟲核型多角體病毒、家蠶核型多角體病毒等桿狀病毒等，所制備的抗體可能對含有多角體蛋白的其它桿狀病毒也能特異性結(jié)合，因此有必要作進(jìn)一步研究，以明確目前所篩選出的是否是只對EoNPV專一性結(jié)合的單克隆抗體，進(jìn)而建立更加完善的定性定量檢測EoNPV的方法。

[1] Zhang YM, Wang XL, Zhang SM, et al. Primary studies on the Ultrastructure of Ecotropis obliqua nuclear polyhedrosis virus. Chin Sci Bull, 1985(24): 1918?1920.張益民, 王學(xué)蘭, 張世敏, 等. 茶尺蠖核型多角體病毒超微結(jié)構(gòu)的初步研究. 科學(xué)通報(bào), 1985(24): 1918?1920.

[2] Du JL, Zhang CX, Xiao Q, et al. Development of the fluorescent quantitative PCR for detection of EoNPV in Ectropis oblique. J Tea Sci, 2010, 30(3): 203?207.杜軍利, 張傳溪, 肖強(qiáng), 等. 茶尺蠖核型多角體病毒熒光定量 PCR檢測方法的建立. 茶葉科學(xué), 2010, 30(3): 203?207.

[3] Liu NC, Meng XL. Analysis of the structural polypeptides of nuclear polyhedrosis virus From Buzura suppressaria guenee. Virol Sin, 1988(1): 48?53.劉年翠, 孟小林. 油桐尺蠖核型多角體病毒結(jié)構(gòu)多肽的分析. 病毒學(xué)雜志, 1988(1): 48?53.

[4] Zhang YL, Zhong J, Su DM, et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus. J Fudan Univer: Nat Sci, 2001, 40(5): 504?508.張亞力, 鐘江, 蘇德明, 等. 斜紋夜蛾核型多角體病毒單克隆抗體的制備和分析. 復(fù)旦學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2001, 40(5): 504?508.

[5] Li XJ, Jiang H, Gao HP, et al. Expression and purification of the excision repair crosscomplementing 1 and preparation of its monoclonal antibodies. Chin J Cell Mol Immunol, 2008, 24(11): 1104?1109.李曉杰, 蔣華, 高慧萍, 等. ERCC1的表達(dá)純化及其單克隆抗體的制備. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2008, 24(11): 1104?1109.

[6] Cui SJ, Guo X, Yang HC, et al. Preparation of monoclonal antibodies against hemagglutinin of a subtype H5 avian influenza virus. Chin J Vet Med, 2006, 42(7): 17?19.崔淑鵑, 郭鑫, 楊漢春, 等. H5亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備. 中國獸醫(yī)雜志, 2006, 42(7): 17?19.

[7] Song S, Ling T, Shao JJ, et al. Preparation and characterization of monoclonal antibody against Foot-and-mouth disease virus serotype O. Chin J Prev Vet Med, 2009, 31(4): 325?328.宋帥, 林彤, 邵軍軍, 等. O型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備和鑒定. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 31(4): 325?328.

[8] Long M, Yang ZT, Zhang NS, et al. Preparation of monoclonal antibody of danofloxacin. Anim Hus Vet Med, 2008, 40(11): 73?75.龍淼, 楊正濤, 張乃生, 等. 達(dá)氟沙星單克隆抗體的制備與鑒定. 畜牧與獸醫(yī), 2008, 40(11): 73?75.

[9] Wang YR, Li L, Liu WM, et al. Preparation and identification of monoclonal antibodies against MATSA. J Northwest A & F Univ: Nat Sci Ed, 2009, 37(6): 25?28.王業(yè)榮, 李立, 劉文明, 等. 抗MATSA單克隆抗體的制備與鑒定. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 37(6): 25?28.

[10] Li HY, Xin XG, Tian GB, et al. Optimum for indirect enzyme linked immunosorbent assay for detection of antibodies to avian influenza virus in chicken. Chin J Anim Poul Infect Dis, 1998, 20(4): 233?235.李海燕, 辛?xí)怨? 田國斌, 等. 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測禽流感抗體的最佳工作條件. 中國畜禽傳染病, 1998, 20(4): 233?235.

[11] Martyn JC, Gould AR, Eaton BT. High level expression of the major core protein VP7 and the non-structural protein NS3 of bluetongue virus in yeast: use of expressed VP7 as a diagnostic, group-reactive antigen in a blocking ELISA. Virus Res, 1991, 18(2/3): 165?178.

[12] Zhao YL, Wang JH, Wang ZL, et al. Preparation of monoclonal antibody and development of ciELISA kit for rapid detection of enrofloxacin. J Northwest A & F Univ: Nat Sci Ed, 2009, 37(2): 33?39.趙銀麗, 王建華, 王自良, 等. 恩諾沙星單克隆抗體的制備及ciELISA試劑盒的研制. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 37(2): 33?39.

[13] Zeng J, Yang CY, Pang W, et al. Preparation of monoclonal antibodies against tomato Ringspot virus. J Microbiol, 2007, 27(3): 35?37.曾潔, 楊翠云, 潘衛(wèi), 等. 番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體的制備. 微生物學(xué)雜志, 2007, 27(3): 35?37.

[14] K?hler G, Milstein C. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur J Immunol, 1976, 6(7): 511?519.

[15] Lian XW, Du XH, Li KS, et al. Development and identification of monoclonal antibodies against H5N1 subtype avian influenza virus. J Gansu Agri Univ, 2007, 42(2): 26?29.連曉雯, 杜惠芬, 李克生, 等. 抗H5N1型禽流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 42(2): 26?29.

[16] Pang HZ, Huang X, Yao XY, et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against RalB. J Sichuan Univ: Med Sci Edi, 2008, 39(4): 651?653.潘華政, 黃湘, 姚小艷, 等. 抗 RalB單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用. 四川大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2008, 39(4): 651?653.

[17] Guo YJ, Yang JX, Hua QY, et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against epizootic hemorrhagic disease virus. Progress Vet Mede, 2009, 30(3): 14?17.郭瑩潔, 楊俊興, 花群義, 等. 鹿流行性出血病病毒單克隆抗體的制備與鑒定. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 30(3): 14?17.

[18] Su JQ, Qiu MS, Wang HL, et al. Generation and characterization of monoclonal antibodies against canine distemper virus. J Jilin Agric Univ, 2009, 31(1): 88?92.蘇建青, 岳妙姝, 王化磊, 等. 犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及特性鑒定. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 31(1): 88?92.

[19] Ma XC, Shang JY, Yang ZN, et al. Genome sequence and organization of a nucleopolyhedrovirus that infects the tea looper caterpillar, Ectropis obliqua. Virology, 2007, 360(1), 235?246.

[20] Chen SW, Wei YJ, Long QX, et al. Research advances on structures and functions of baculovirus p10 genes and proteins. Virol Sin, 1998, 13(3): 185?191.陳尚武, 魏永杰, 龍綮新, 等. 桿狀病毒p10基因及蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展. 中國病毒學(xué), 1998, 13(3): 185?191.

[21] Wang LZ, Xiao Q, Zhang CX. Preparation of the antibody against EupsNPV polyhedrin and its utilization in detection of the viral pesticide. J Tea Sci, 2008, 28(4): 260?266.王禮中, 肖強(qiáng), 張傳溪. 茶毛蟲核型多角體病毒ph基因抗體的制備與利用. 茶葉科學(xué), 2008, 28(4): 260?266.

[22] Wang JK, Cheng SP, Yan XJ, et al. Preparation and biological characteristic of monoclonal antibodies against mink enteritis virus. Chin Vet Sci, 2009, 39(3): 227?232.王建科, 程世鵬, 閆喜軍, 等. 抗水貂腸炎病毒單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性鑒定. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2009, 39(3): 227?232.

[23] Chen XQ, Xu GL, Wang JL, et al. Primary studies and application of monoclonal antibody against respiratory syncytial virus. Chin J Immunol, 2007, 23(11): 1015?1018.陳曉琦, 徐葛林, 王繼麟, 等. 呼吸道合胞病毒單克隆抗體的制備及鑒定. 中國免疫學(xué)雜志, 2007, 23(11): 1015?1018.

[24] Wang Q, Luo JL, Jiang WH, et al. Preparation and identification of monoclonal antibody against Newcastle disease virus. J South China Agri Univ, 2009, 30(2): 112?114.王琴, 羅晶璐, 蔣文鴻, 等. 新城疫病毒單克隆抗體的制備及鑒定. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 30(2): 112?114.

[25] Shi ML, Wu JX, Guo W, et al. Preparation of monoclonal antibodies to Turnip Mosaic Virus and its application for the virus detection. Acta Microbiol Sin, 2004, 44(2): 186?188.施曼玲, 吳建祥, 郭維, 等. 蕪菁花葉病毒單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用. 微生物學(xué)報(bào), 2004, 44(2): 186?188.

[26] Wang Y, Zhang L, Rao X, et al. Establishment of McAb-based competitive ELISA for detection of Chloramphenicol. Chin J Lab Diagn, 2007, 11(11): 1530?1533.王穎, 張磊, 饒星, 等. 氯霉素單克隆抗體ELISA檢測方法的建立. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2007, 11(11): 1530?1533.

[27] Wang GZ, Zhou YJ, Chen ZX, et al. Production of monoclonal antibodies to Rice stripe virus and application in virus detection. Acta Phytopathol Sin, 2004, 34(4): 302?306.王貴珍, 周益軍, 陳正賢, 等. 水稻條紋病毒單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用. 植物病理學(xué)報(bào), 2004, 34(4): 302?306.

[28] Meng CM, Wu JX, Xie L, et al. Production of monoclonal antibodies to Cymbidium mosaic virus and application in Orchids virus detection. Acta Microbiol Sin, 2007, 47(5): 928?931.孟春梅, 吳建祥, 謝禮, 等. 建蘭花葉病毒單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用. 微生物學(xué)報(bào), 2007, 47(5): 928?931.

[29] Hu GJ, Lu ZQ, Hang SB, et al. Applications of monoclonal antibody technique in the studies of insect baculoviruses. Chin J Biol Control, 1993, 9(2): 76?79.胡廣淦, 陸自強(qiáng), 杭三保, 等. 單克隆抗體技術(shù)在昆蟲病毒研究中的應(yīng)用. 生物防治通報(bào), 1993, 9(2): 76?79.

[30] Roberts PL, Naser W. Characterization of monoclonal antibodies to the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Virology, 1982, 122(2): 424?430.

[31] Hohman AW, Faulkner P. Monoclonal antibodies to baculovirus structural proteins: determination of specificities by Western blot analysis. Virology, 125(2): 432?444.