臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌耐消毒劑基因攜帶情況分析及消毒對(duì)策

于文靜 聞海豐 秦瑾 馮忠軍

消毒劑常被醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用于各種醫(yī)療設(shè)施和環(huán)境表面的消毒［1］，在預(yù)防和控制病原菌在醫(yī)院內(nèi)的傳播方面起到了重要的作用，但消毒劑的長(zhǎng)期廣泛使用有可能使細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)消毒劑環(huán)境的適應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)消毒劑產(chǎn)生抗性。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中檢出攜帶耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1的菌株，且攜帶率較高［2-5］。鮑曼不動(dòng)桿菌具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和獲得外源性耐藥基因的能力［6］。因此做好鮑曼不動(dòng)桿菌耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1的監(jiān)測(cè)，了解其對(duì)常用消毒劑的抗性，將有助于合理選擇與使用消毒劑，對(duì)控制其傳播有重要的意義。本文對(duì)臨床分離的73株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌qacEΔ1-sul1基因的攜帶情況及其含氯消毒劑的耐受狀態(tài)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 試驗(yàn)菌株分離自河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院2012年10月至2013年6月住院患者及其住院環(huán)境的送檢標(biāo)本(排除同一患者重復(fù)分離菌株)，其中男50例，女19例;年齡1～89歲。標(biāo)本來(lái)源主要為:痰液37株、血液5株、傷口分泌物22株、ICU環(huán)境表面分離4株，尿液、導(dǎo)管、腹水、腦脊液、咽試子各1株。標(biāo)本來(lái)自科室主要是ICU 29株，創(chuàng)傷急救中心11株，急診科7株，其余菌株分布在不同的科室。全部菌株均符合多重耐藥菌的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)ID32E鑒定試劑卡鑒定后，采用濾紙保存法，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑ABI7300型熒光定量PCR檢測(cè)儀為美國(guó)生物應(yīng)用公司產(chǎn)品，腸桿菌科和其他非苛氧革蘭陰性鑒定試劑為由法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品，DNA Marker 1由廣東東盛生物技術(shù)有限公司提供，綠色體系［Green PCR Master Mix(2x)］由Fermentas提供，核酸染料GoldViewⅠ由北京索萊寶科技有限公司提供;含氯消毒劑為泡騰消毒片Ⅱ型，主要成分為三氯異氰尿酸，由山東利爾康消毒科技股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備:在含有菌株的EP管中加入2 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯，孵育過(guò)夜，后接種到哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，孵育過(guò)夜后取典型的菌落，懸浮于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中，配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙簜溆谩?/p>

1.3.2 藥敏試驗(yàn):采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定13種抗菌藥物的敏感性，包括哌拉西林、頭孢他啶、亞胺培南、頭孢哌酮、頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。由溫州市康泰生物科技有限公司提供，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922，根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2010年版進(jìn)行抗菌藥物敏感性判斷。

1.3.3 耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1檢測(cè)qacEΔl-sul1基因引物序列［6］如下:P1:5’-TAGCGAGGG CTTT ACTAAGC-3’，P2:5’-ATTCAGAATGCCGAACACCG-3’，PCR擴(kuò)增后陽(yáng)性產(chǎn)物長(zhǎng)度為300bp。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒由北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司提供;PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:P1引物2 μl(10 μmol/L)、P2引物2 μl(10 μmol/L)，PCR反應(yīng)液Green PCR Master Mix(2x)25 μl、模板3 μl、超純水18 μl，總反應(yīng)體積50 μl。PCR熱循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性2 min，然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳35 min，電壓100 V，出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶判為陽(yáng)性，并拍照保存。

1.3.4 消毒劑敏感性檢測(cè):對(duì)73株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)按《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002年版)規(guī)定的最小抑菌濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)(營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法)進(jìn)行檢測(cè)。取一片消毒片有效氯濃度為500 mg/L放入到500 ml蒸餾水中，配成濃度為1 000 mg/L的消毒液，然后將消毒液稀釋成500 mg/L、400 mg/L、300 mg/L、250 mg/L。分別將2.5 ml不同濃度的消毒液加到無(wú)菌試管中，再向各管中加2.5 ml的雙倍營(yíng)養(yǎng)肉湯。最后在管中加入70 μl(1.5×108cfu/ml)菌懸液混勻，使其含菌量為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。將試驗(yàn)菌、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照試管放置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗(抑)菌劑濃度為消毒劑判為受試菌的MIC。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果73株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥物的藥敏結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 73株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果株(%)

2.2 耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1檢測(cè)結(jié)果73株鮑曼不動(dòng)桿菌中37株qacEΔ1-sul1基因陽(yáng)性，陽(yáng)性率為50.68%。見(jiàn)圖1。

圖1 耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1檢測(cè)結(jié)果

2.3 MIC檢測(cè)結(jié)果 含氯消毒劑對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的平均MIC值為365.07 mg/L。見(jiàn)表2。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)含氯消毒劑MIC測(cè)定結(jié)果

3 討論

近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性日益增強(qiáng)，可以通過(guò)固有的耐藥基因或獲取外源基因元件如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子或耐藥基因島使其成為多重耐藥或泛耐藥的菌株［7］，給臨床治療帶來(lái)極大的困難。本研究結(jié)果顯示臨床分離的菌株除對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性為21.91%以外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率高達(dá)86.30%～97.26%，可見(jiàn)臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥情況嚴(yán)重。在分離的73株鮑曼不動(dòng)桿菌中，有29株分離自ICU病房，11株分離自骨科創(chuàng)傷急救病房，在這些病房中病人的免疫力低下，且接受侵入性操作，更增加了鮑曼不動(dòng)桿菌感染的機(jī)會(huì)。對(duì)于多重耐藥菌的感染患者，臨床除了使用抗菌藥物治療之外，各種消毒劑的使用也是非常有效的控制措施。

研究表明，隨著消毒劑大量廣泛的應(yīng)用，由于往往存在有機(jī)物(血、組織、體液、脂質(zhì)等)干擾，常導(dǎo)致細(xì)菌反復(fù)接觸亞致死量消毒劑，部分病原菌出現(xiàn)對(duì)某些消毒劑的敏感性降低甚至耐藥的情況，這與耐抗生素菌株一樣，抗消毒劑菌株的出現(xiàn)可能將會(huì)導(dǎo)致醫(yī)院消毒的失敗［8-10］。其原因有細(xì)菌細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)或化學(xué)組成(外膜蛋白和脂多糖等)引起的對(duì)某些消毒劑的天然抗性;有的細(xì)菌則可因細(xì)胞基因的改變(質(zhì)粒通過(guò)攜帶專(zhuān)門(mén)的抗性基因而介導(dǎo))可產(chǎn)生獲得性抗力;也可能由于消毒劑選擇壓力導(dǎo)致突變株的出現(xiàn)。細(xì)菌耐消毒劑主要為獲得qac基因所致。qac基因表達(dá)多種消毒劑化合物外排泵蛋白，獲得qac基因可表現(xiàn)為對(duì)胺類(lèi)、胍類(lèi)、腙類(lèi)消毒劑耐藥。目前已發(fā)現(xiàn)的qac基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacE△1、qacF、qacG、qacH、qacJ等10種［10］。

鮑曼不動(dòng)桿菌作為臨床主要病原菌之一，其對(duì)消毒劑敏感性降低的報(bào)道不一［1，11，12］，但耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1的攜帶率較高，本研究中幾乎一半菌株攜帶此基因，與文獻(xiàn)中報(bào)道［5，6］的基本一致。細(xì)菌對(duì)消毒劑產(chǎn)生抗性有可能會(huì)對(duì)細(xì)菌的抗生素耐藥產(chǎn)生影響。含氯消毒劑為一種高效消毒劑，可殺滅包括細(xì)菌芽孢在內(nèi)的所有微生物。醫(yī)院中一般污染物品和環(huán)境物體表面消毒都采用有效氯為250～500 mg/L，本研究采500、400、300、250 mg/L不同濃度梯度的消毒劑對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行消毒劑耐藥性監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明殺菌效果良好。消毒劑的大量使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)消毒劑的敏感性降低，但是消毒劑耐藥細(xì)菌在自然界的水平很低，并且對(duì)消毒劑耐藥的濃度也遠(yuǎn)低于在醫(yī)院、家庭和工業(yè)等環(huán)境中的正常使用濃度。臨床不規(guī)范使用消毒劑和未妥善保存消毒劑可能使消毒劑有效成分降低，因此在臨床實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)菌株種類(lèi)選擇合適的消毒劑，以免受先天抗性的影響。而且在應(yīng)用消毒劑時(shí)，以大劑量一次將菌全部殺死為宜。另外，選擇壓力在細(xì)菌對(duì)消毒劑抗性中的作用也不容忽視。

雖然抗生素和消毒劑對(duì)細(xì)菌的作用靶位、殺菌效果、性能和臨床應(yīng)用方面有所不同，但也存在很多相似之處:通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散作用穿過(guò)細(xì)菌包膜，影響膜的形態(tài)和完整性，影響細(xì)菌的代謝過(guò)程(核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和各種酶的活性)。細(xì)菌對(duì)抗生素和消毒劑也表現(xiàn)出相似的防御機(jī)制，例如通過(guò)滲透性改變、外排作用、形成生物膜和對(duì)抗生素和消毒劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)基因突變或獲得可移動(dòng)的基因元件(如轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒)編碼耐藥物質(zhì)(酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)。抗生素耐藥和消毒劑耐藥存在共同的調(diào)節(jié)通路。多數(shù)主動(dòng)外排泵為廣譜，能外排包括抗菌藥物和消毒劑在內(nèi)的多種有害物質(zhì)。不少抗菌藥物耐藥基因由質(zhì)粒攜帶，而質(zhì)粒上可攜帶如qac等外排基因?？咕幬锖拖緞┛赡苡泄餐饔玫奈稽c(diǎn)，靶位改變將帶來(lái)對(duì)抗菌藥物和消毒劑的敏感性降低。對(duì)抗菌藥物耐藥不一定會(huì)導(dǎo)致對(duì)消毒劑敏感性降低，多重耐藥菌是否會(huì)對(duì)消毒劑敏感性降低取決于菌種和耐藥機(jī)制。值得注意的是，共同的耐藥機(jī)制可能導(dǎo)致對(duì)抗菌藥物和消毒劑交叉耐藥。使用亞致死量的消毒劑可導(dǎo)致對(duì)抗菌藥物的MIC上升，實(shí)驗(yàn)條件下，某種消毒劑(如三氯生)可誘導(dǎo)出對(duì)抗菌藥物敏感性降低的菌株。但在臨床中，關(guān)于消毒劑使用可誘導(dǎo)或篩查出抗菌藥物耐藥菌株的報(bào)道尚未見(jiàn)到。況且，實(shí)驗(yàn)室條件下誘導(dǎo)的對(duì)消毒劑敏感性降低的菌株能夠被工作濃度的消毒劑殺滅，因而這些敏感性降低的菌株臨床意義很小。本研究顯示，耐藥菌對(duì)消毒劑的抵抗力變化不明顯，即使出現(xiàn)抵抗力，也只是最低抑菌濃度(MIC)提高2～3倍。

正如抗菌藥物濫用導(dǎo)致高耐藥率一樣，細(xì)菌耐消毒劑現(xiàn)象也逐漸突顯出來(lái)。因此，要重視消毒劑在臨床上的規(guī)范使用，醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)該建立專(zhuān)門(mén)的消毒管理組織，加強(qiáng)科學(xué)使用消毒劑的管理和培訓(xùn)。根據(jù)醫(yī)院實(shí)際情況，將醫(yī)療機(jī)構(gòu)環(huán)境清潔衛(wèi)生等級(jí)進(jìn)行分類(lèi)，并根據(jù)環(huán)境感染危險(xiǎn)度類(lèi)別和清潔衛(wèi)生等級(jí)管理要求制定標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，內(nèi)容應(yīng)包括清潔與消毒的工作流程、時(shí)間和頻率。應(yīng)明確使用的清潔劑與消毒劑名稱(chēng)、配制濃度、作用時(shí)間，以及使用中清潔劑與消毒劑更換的空間和時(shí)間規(guī)定等;明確醫(yī)務(wù)人員與環(huán)境清潔衛(wèi)生服務(wù)人員的職責(zé)分工，指導(dǎo)臨床正確進(jìn)行消毒，強(qiáng)調(diào)預(yù)防先于控制，提高手衛(wèi)生依從性。積極開(kāi)展臨床菌株對(duì)消毒劑敏感性監(jiān)測(cè)及其相關(guān)研究，密切關(guān)注其變化趨勢(shì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)臨床菌株對(duì)消毒劑抗性的變化，以便有針對(duì)性地調(diào)整消毒劑在臨床實(shí)際工作中的有效使用濃度，甚至及時(shí)更換消毒劑種類(lèi)，共同應(yīng)對(duì)臨床菌株對(duì)消毒劑耐藥性的挑戰(zhàn)。

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