CETP基因I405V突變與腦梗死的關(guān)系

劉建群

腦梗死(cerebral infarction)是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，其主要病理性改變是局部腦組織由于缺氧缺血導(dǎo)致腦組織壞死軟化。腦梗死病因多樣，往往造成嚴(yán)重后遺癥甚至死亡，且有逐年上升的趨勢，雖然近年來有多種治療方法使病死率有所下降，但致殘率依然很高，病后患者的生活質(zhì)量明顯下降，給患者家屬帶來沉重的負(fù)擔(dān)。研究表明腦梗死的發(fā)生與多種因素有關(guān)，高血壓、高血脂、血糖異常都是導(dǎo)致腦梗死的重要原因;吸煙等不良嗜好也是腦梗死的危險(xiǎn)因素［1］。但這些原因還不能完全解釋腦梗死的病因，許多患者沒有上述常見的容易導(dǎo)致腦梗死發(fā)生的危險(xiǎn)因素，因此遺傳因素的作用日益得到重視。膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)的主要功能是協(xié)助脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)機(jī)體血脂水平。血漿中受CETP的脂蛋白主要有高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)，CETP可以調(diào)節(jié)這些脂蛋白的顆粒體積及組成成分［1］。故CETP與脂質(zhì)代謝關(guān)系密切，也是動脈粥樣硬化的易感基因之一［2］。腦梗死的直接病因之一就是動脈粥樣硬化，因此CETP表達(dá)異?？赡芘c腦梗死發(fā)生有關(guān)，但具體關(guān)系相關(guān)報(bào)道罕見。由于CETP基因多態(tài)性與多種疾病有關(guān)［3，4］，為了解CETP基因多態(tài)性對腦梗死的影響，本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)結(jié)合DNA測序方法，對我院診治的漢族腦梗死患者CETP基因變異情況進(jìn)行了較為深入的研究，對I405V突變在對照組與腦梗死組的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行了計(jì)算，對CETP I405V突變對腦梗死的影響及其相關(guān)性進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年7月至2013年6月在河北省遷安市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院及門診診治的急性腦梗死患者(試驗(yàn)組)，共350例，其中男206例，女144例;年齡42～65歲，平均年齡(48±10)歲。腦梗死均按全國第四屆腦血管病會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，所有病例均有顱腦CT或MRI證實(shí)為腦梗死。選取同期來我院門診體檢的健康人群為對照組，共331例，其中男190例，女141例;年齡34～53歲，平均年齡(47±15)歲，對照組均無心、腦、肝、腎疾病，無糖尿病、甲亢、甲減及近期感染史。所有入選個(gè)體均為久居于河北省的漢族人群，均自愿簽署知情同意書，并得到河北省遷安市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集:入選者過夜空腹12 h，于次日采集隔夜空腹靜脈血，留取4 ml，置于促凝管中，室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min，分離血清，用于血清指標(biāo)的測定;另取抗凝血4 ml，迅速置于-80℃保存，用于提取DNA。

1.2.2 血清指標(biāo)的測定:用酶法檢測總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、HDL-c、極低密度脂蛋白-膽固醇(VLDL-c)測定。LDL-c水平按Friedewald公式計(jì)算獲得(LDL-c=TC-HDL-c-TG/2.2)。采用的儀器為日立全自動生化分析儀7600。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定CETP水平:CETP試劑盒E0814h購自武漢中美公司，最小可測人CETP濃度為0.78 ng/ml;板內(nèi)變異系數(shù)、板間變異系數(shù)均＜10%。測定方法嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書操作。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)耗材與設(shè)備試劑:TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、KOD plus(Pfu DNA聚合酶)、dNTP酶、引物;Biowest Agarose進(jìn)口分裝瓊脂糖，DL500TM DNA Marker(Takara);其他試劑為國產(chǎn)分析純。Mastercycler gradient PCR儀(Eppendorf)，ABI PRISM 377 DNA測序電泳儀(ABI)。

1.2.5 人外周血基因組DNA提取方法:取空腹靜脈血(抗凝)4 ml，嚴(yán)格按天根TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書提取外周血液中基因組DNA。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 DNA濃度及純度測定:吸取5 μl DNA樣品加雙蒸水至1 ml，混勻后，轉(zhuǎn)入1 ml石英比色杯中于DNA/RNA/蛋白測定儀中測定260 nm，280 nm處的吸光度，DNA/RNA/蛋白測定儀先用1 ml雙蒸水校正零點(diǎn)。DNA樣品濃度=OD260×200×50(μg/ml)DNA樣品純度=OD260/OD280。

1.2.7 PCR擴(kuò)增CETP基因14外顯子:所用引物分別由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司及北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為上游5’-CTCACCATGGGCATTTGATTGCAGAGCAGCTCCGAC-3’，下游5’-AAAGGTGAAATGGGAAGCTCTGTCAGCCTCGG-3’。PCR反應(yīng)體系:共25 μl，包括:DNA模板4 μl，上下游引物各2 μl，KOD plus 1 μl，Buffer 2 μl，dNTP Mixture 2 μl，雙蒸水12 μl。PCR反應(yīng)采用降落聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-RFLP)，反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)［6］。所得產(chǎn)物進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。

1.2.8 核苷酸序列分析:將CETP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接測序，測序方法為雙向測序。測序結(jié)果用DNAMAN軟件(V6.0.3.99漢化版)與GenBank的CETP基因序列進(jìn)行比對。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);OR與95%CI用做評估CETP基因I405V突變位點(diǎn)基因多態(tài)性對冠心病腦梗死風(fēng)險(xiǎn)的影響情況。另外采用多變量Logistic回歸分析模型在調(diào)整性別、年齡、吸煙史、飲酒史、收縮壓和舒張壓、TC、TG、HDL-C后分析CETP基因I405V位點(diǎn)基因多態(tài)性對腦梗死的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般情況及CETP濃度的比較2組的年齡、血壓無明顯差異;試驗(yàn)組血脂指標(biāo)中TC、TG、LDL-c與對照組比較明顯升高，而HDL-c則明顯低于對照組(P＜0.05)。試驗(yàn)組患者的吸煙及陽性家族史的比例均高于對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 CETP基因 第14外顯子I405V突變位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果PCR產(chǎn)物純化后送往北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)存在等位基因A和G，基因型分為ⅠⅠ、ⅠⅤ、ⅤⅤ三種類型。見圖1。

2.3 CETP基因I405V突變位點(diǎn)基因多態(tài)性分析結(jié)果CETP基因I405V突變位點(diǎn)等位基因G在試驗(yàn)組的頻率為0.5700，明顯高于對照組的頻率0.3097(P＜0.05)。試驗(yàn)組的GG及AG基因型明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 2組一般情況及CETP濃度的比較

圖1 CETP基因I405V突變位點(diǎn)多態(tài)性分析的測序結(jié)果

表2 2組CETP基因I405V位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布情況 例(%)

2.4 CETP基因I405V位點(diǎn)與腦梗死的關(guān)系CETP基因I405V位點(diǎn)與腦梗死有相關(guān)關(guān)系，與A/G、A/A基因型相比，G/G基因型能顯著增加腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。OR(95%CI)值 為6.41(4.36～21.88)，調(diào)整了性別、年齡、吸煙史、飲酒史、收縮壓和舒張壓、TC、TG、HDL-c之后OR值為8.27(5.43～32.57)。見表4。

表4 KCTD15基因I405V位點(diǎn)突變與腦梗死的關(guān)系

3 討論

腦梗死是近年來神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，致殘率與病死率居高不下，而且還有年輕化的趨勢，已經(jīng)引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［7］。目前遺傳因素是研究的熱點(diǎn)，許多學(xué)者對腦梗死患者易感基因的多態(tài)性展開研究。有研究發(fā)現(xiàn)CETP基因與高膽固醇血癥關(guān)系密切［8，9］，而高膽固醇血癥又是腦梗死的主要發(fā)病原因之一，但到目前為止有關(guān)兩者之間關(guān)系的研究報(bào)道較少，因此我們對CETP基因引起腦梗死的發(fā)病機(jī)制展開研究。

CETP基因位于16號染色體，包括16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，該基因可以調(diào)節(jié)血漿膽固醇和TG在HDL與LDL、VLDL之間的交換，CETP基因的這種功能對于調(diào)節(jié)血漿HDL水平有重要意義，在膽固醇由外周組織運(yùn)送到肝臟這一過程中發(fā)揮重要作用［10］。CETP基因突變與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，部分突變可以改變CETP的活性，對脂代謝過程產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)CETP的濃度在試驗(yàn)組與對照組中存在明顯差異，明顯高于對照組(P＜0.05)，提示CETP與腦梗死的發(fā)生可能有關(guān)，這一結(jié)論與汪俊軍等［11］的研究相符。

CETP基因的I405突變是第14外顯子上的錯(cuò)義突變，405Lle→Val(I405V)，即第405位氨基酸的第一個(gè)密碼子由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致第405位天冬異亮氨酸(Lle)變異為纈氨酸(Val)，這一突變位點(diǎn)靠近脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性中心，影響了CETP的生物合成，還極有可能影響其生物活性。在我們的研究中，選取了性別年齡相近的試驗(yàn)組和對照組，結(jié)果顯示CETP基因I405V突變在對照組ⅠⅠ/ⅠⅤ/ⅤⅤ基因型分別占50.8%，36.5%，12.7%，試驗(yàn)組ⅠⅠ/ⅠⅤ/ⅤⅤ基因型分別占24.3%，37.4%，38.3%，試驗(yàn)組ⅤⅤ基因型明顯高于對照組，在2組間存在明顯差異，同時(shí)試驗(yàn)組G等位基因的頻率是57%，而對照組的G等位基因的頻率是30.97%，試驗(yàn)組明顯高于正常對照組。腦梗死是一種受環(huán)境與遺傳因素共同影響的復(fù)雜疾病，本研究中試驗(yàn)組I405V的突變頻率明顯高于對照組，提示CETP基因的I405V突變可能是引起腦梗死的原因之一，另外CETP基因I405V突變位點(diǎn)G/G基因型引發(fā)腦梗死的危險(xiǎn)性O(shè)R(95%CI)值為6.41(4.36～21.88)，調(diào)整了性別、年齡、吸煙史、飲酒史、收縮壓和舒張壓、TC、TG、HDL-C之后為8.27(5.43～32.57)，明顯高于AA/AG基因型，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了CETP基因I405V突變位點(diǎn)與腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有顯著的相關(guān)性。

本研究證實(shí)了腦梗死患者血清中CETP濃度高于對照組，且CETP基因I405V突變與腦梗死的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，但其中具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1 Wright RS.Recent clinical trials evaluating benefit of drug therapy for modification of HDL cholesterol.Curr Opin Cardiol，2013，28:389-398.

2 Bochem AE，Kuivenhoven JA，Stroes ES.The promise of cholesteryl ester transfer protein(CETP)inhibition in the treatment of cardiovascular disease.Curr Pharm Des，2013，19:3143-3149.

3 Charles MA，Kane JP.New molecular insights into CETP structure and function:a review.J Lipid Res，2012，53:1451-1458.

4 Ghosh RK，Ghosh SM.Current status of CETP inhibitors in the treatment of hyperlipidemia:an update.Curr Clin Pharmacol，2012，7:102-110.

5 吳遜.全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議紀(jì)要.卒中與神經(jīng)疾病，1997，4:105-109.

6 張明明，霍麗靜，孫海娟，等.高膽固醇血癥患者LL-R基因XspⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與血清IL-6的關(guān)系及意義.臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29:596-598.

7 Sharma VK，Kawnayn G，Sarkar N.Acute ischemic stroke:comparison of low-dose and standard-dose regimes of tissue plasminogen activator.Expert Rev Neurother，2013，13:895-902.

8 Niesor EJ，von der Mark E，Calabresi L，et al.Lipid and apoprotein composition of HDL in partial or complete CETP deficiency.Curr Vasc Pharmacol，2012，10:422-431.

9 Salakhutdinov NF，Rogoza LN，Tolstikov GA.Hypercholesterolemia:chemical aspect of approach.Curr Med Chem，2011，18:4076-4105.

10 Sofat R，Hingorani AD，Smeeth L，et al.Separating the mechanism-based and off-target actions of cholesteryl ester transfer protein inhibitors with CETP gene polymorphisms.Circulation，2010，121:52-62.

11 汪俊軍，顧勤花，張春妮.高脂血癥人群血清膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平.中國動脈硬化雜志，2006，14:1038-1040.