黃芪多糖對免疫功能影響的體外實驗研究

劉印華 李樹義 趙志強(qiáng) 張慶波

黃芪桂枝五物湯載于《金匱要略·血痹虛勞病脈證治》，該方由黃芪、芍藥、桂枝、生姜、大棗五味藥組成，具益氣溫經(jīng)、和營通脈之功［1］。原方主要是治療血痹，而現(xiàn)代臨床應(yīng)用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了原方“血痹”癥的范疇，尤其是在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、微循環(huán)障礙和腦中風(fēng)后遺癥等方面，收到滿意的療效［2］。長期以來備受中醫(yī)學(xué)者青睞，是臨床常用經(jīng)典名方之一。黃芪是黃芪桂枝五物湯中的主要成分之一，黃芪多糖具有多種重要的生物學(xué)作用，包括對免疫功能的影響，但黃芪多糖對機(jī)體免疫功能影響的系統(tǒng)研究，經(jīng)河北省醫(yī)學(xué)情報研究所查新(編號:13010520130618)目前在國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報道。本項目將通過小鼠脾細(xì)胞體外實驗，系統(tǒng)研究黃芪多糖對免疫功能的影響，為臨床應(yīng)用和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪多糖:由河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院提供。測增殖用試劑WST-1:購于江蘇碧云天生物科技公司。

1.2 實驗用動物 取4～6周齡昆明種小鼠，體重(20±2)g，雌雄各半，SPF級，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。(合格證編號:0123883)

1.3 小鼠脾細(xì)胞增殖活性的測定 取5周齡小鼠4只，雌雄各2只，頸椎脫臼處死，無菌分別取脾臟，細(xì)胞篩研磨成脾淋巴細(xì)胞懸液，加入1 ml蒸餾水破碎紅細(xì)胞，30 s后加入1.8%氯化鈉溶液，PBS洗細(xì)胞3次，計數(shù)細(xì)胞數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×106/ml。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加100 μl細(xì)胞懸液，10 μl不同濃度的黃芪多糖溶液(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml)，同時設(shè)不加黃芪多糖的對照組。每組設(shè)3個復(fù)孔，置CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、6、9 d，用WST-1測OD值，4只小鼠取均值。

1.4 小鼠IL-2，IFN-γ的測定 上述細(xì)胞測定增殖前，取上清50 μl置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩悠肥占戤吅?，分別檢測IFN-γ、IL-2的含量(按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的要求操作)。

1.5 細(xì)胞亞群分析 檢測小鼠脾細(xì)胞中CD+3細(xì)胞和細(xì)胞。取小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，以5×106/ml的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1.5 ml，實驗組加入2.0 mg/ml的黃芪多糖溶液0.5 ml，對照組加入0.5 ml RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 d后，取細(xì)胞懸液，1500轉(zhuǎn)/min，離心5 min;PBS洗滌;加入FITC進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)(100 μl細(xì)胞懸液∶100 μl抗體)，避光孵育30 min;PBS洗2次，每管加入200 μl 1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對小鼠免疫細(xì)胞增殖活性的影響 實驗結(jié)果顯示黃芪多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞有刺激增殖作用，其最佳濃度為2 mg/ml(P＜0.05或＜0.01)。見表1。

表1 黃芪多糖對小鼠免疫細(xì)胞增殖活性的影響±s

表1 黃芪多糖對小鼠免疫細(xì)胞增殖活性的影響±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

黃芪多糖(mg/ml)3 d6 d9 d 0.47±0.120.86±0.211.11±0.52 0.251.42±0.65*2.54±0.57*2.77±0.73*0.52.78±0.33#3.43±0.36#4.41±0.32#1 3.56±0.66#4.65±0.34#5.52±0.73#2 4.24±0.20#4.87±0.34#6.76±0.56#4 4.31±0.64#4.78±0.39#6.79±0.46 0#

2.2 細(xì)胞上清IFN-γ的測定ELISA檢測結(jié)果顯示:黃芪多糖組IFN-γ的含量顯著高于對照組(P＜0.05或 ＜0.01)。培養(yǎng)3、6和9 d，的黃芪多糖組以2.0 mg/ml濃度最高，高于此濃度時，其含量不再增加。見表2。

表2 IFN-γ的測定n=4，pg/ml，±s

表2 IFN-γ的測定n=4，pg/ml，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

時間(d)黃芪多糖(mg/ml)0(對照)0.250.5124±3 3.65±0.135.66±1.22*6.78±1.02*7.96±1.56#9.47±1.78#9.66±1.77#5.31±1.249.42±1.78*11.56±1.54#13.48±2.78#17.73±2.89#17.62±2.65#9 9.21±1.7617.34±3.15*20.12±3.45#22.31±3.77#29.55±3.96#29.67±4.63 6#

2.3 IL-2的測定 黃芪多糖組IL-2的含量隨著黃芪多糖濃度的增加而升高，以2.0 mg/ml濃度效果最明顯(P＜0.05或 ＜0.01)。見表3。

表3 IL-2的測定n=4，pg/ml，±s

表3 IL-2的測定n=4，pg/ml，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

時間(d)黃芪多糖(mg/ml)0(對照)0.250.5124 3 4.33±0.216.56±0.33*8.47±2.12*9.63±2.11#12.65±3.24#12.45±2.11#7.21±1.3210.23±3.42#12.89±3.24#16.67±3.78#19.68±5.12#19.44±3.89#9 10.34±3.3517.56±5.21#20.33±5.13#21.23±5.77#32.54±6.87#32.64±5.28 6#

表4 CD3亞群的檢測

表5 亞群的檢測

表5 亞群的檢測

組別 細(xì)胞總數(shù)標(biāo)記細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞CD+19細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比(%)χ2值P值10 0002429 7582.7328.8834＜0.001黃芪多糖組對照組10 0004599 5414.59

3 討論

黃芪桂枝五物湯的藥理學(xué)研究主要集中在飲片層次，從整體效果及拆方后藥物的配伍組合，如:王妮等［3］進(jìn)行了黃芪桂枝五物湯加減，治療血液高粘滯綜合征;馬麗［4］用黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變微循環(huán)障礙的患者;趙桂華等［5］運用黃芪桂枝五物湯對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究;許利平等［6］對黃芪桂枝五物湯加味的藥效作用研究證實該方有一定程度的鎮(zhèn)痛、抗氧化作用;黃兆勝等［7］對黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮(zhèn)痛的比較研究將該方按藥對研究法拆方分組;施旭光等［8］進(jìn)行了黃芪桂枝五物湯及其配伍對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究;許曉峰［9］等證實黃芪桂枝五物湯有抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α升高的作用。

對復(fù)方中各單味藥化學(xué)成分及藥理作用研究，如:黃芪中含有的黃芪多糖、皂苷、黃酮等化合物具有較強(qiáng)的生物活性，黃芪皂苷主要作用于心腦血管，通過擴(kuò)張血管達(dá)到降壓目的;黃芪多糖主要作用于多種免疫活性細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌和正常機(jī)體的抗體生成［10］。桂枝的有效成分是揮發(fā)油，主要為桂皮醛和桂皮酸，可擴(kuò)張血管，促進(jìn)發(fā)汗、解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、利尿［11］。芍藥中的主要有效成分為芍藥總苷，現(xiàn)被廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾?。?2］。大棗中含有多種有效成分，如大棗多糖、黃酮類、皂苷類、三萜類、生物堿類等。大棗多糖是大棗中重要的活性物質(zhì)，有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用，可提高機(jī)體免疫力。大棗中的黃酮類物質(zhì)對腦缺血所致的腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷有保護(hù)作用。大棗中所含的皂苷類物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)人體代謝、增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、降血糖和膽固醇等作用［13-15］。

黃芪是黃芪桂枝五物湯中的主要有效成分之一，研究結(jié)果表明:黃芪多糖能刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著黃芪多糖濃度的增加，細(xì)胞增殖效果也隨之增加，IL-2和IFN-γ的分泌量亦如此，具有明顯的量效關(guān)系。相關(guān)研究顯示多糖對B細(xì)胞有促進(jìn)增殖的效果［16］，但對T細(xì)胞的作用則取決于多糖種類［17］，本實驗在檢測細(xì)胞亞群時發(fā)現(xiàn)T、B細(xì)胞均有大幅增長，表明黃芪多糖對機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫均有顯著的增強(qiáng)作用。

黃芪多糖的研究較多，但缺乏對其進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，本項目將對其進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，包括體外研究和體內(nèi)研究，可望對黃芪的作用有全面了解，以便在臨床得到更好的應(yīng)用。

1 黃仰模主編.金匱要略講義.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.71-72.

2 趙蕊，蔣明.黃芪桂枝五物湯的臨床應(yīng)用.黑龍江中醫(yī)藥，2007，4:60-62.

3 王妮，方瑜，袁有財，等.黃芪桂枝五物湯加減治療血液高粘滯綜合征.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，30:19-20.

4 馬麗.黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變微循環(huán)障礙的影響.遼寧中醫(yī)雜志，2006，33:140-141.

5 趙桂華，唐其風(fēng).黃芪桂枝五物湯對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用.中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2006，23:708-709.

6 許利平，胡曉梅，任桂華，等.黃芪桂枝五物湯加味的藥效學(xué)研究.四川生理科學(xué)雜志，1999，21:30.

7 黃兆勝，施旭光，朱偉，等.黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮(zhèn)痛的比較研究.中藥新藥與臨床藥理，2005，16:93-96.

8 施旭光，朱偉，黃兆勝，等.黃芪桂枝五物湯及其配伍對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究.中藥新藥與臨床藥理，2006，22:3-5.

9 許曉峰，林斌，王沛堅.黃茂桂枝五物湯對AA大鼠血清IL-1β、TNF-α的影響.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，7:1202-1204.

10 盧彥琦.黃芪化學(xué)成分及藥理作用綜述.保定師范?？茖W(xué)校學(xué)報，2004，17:40-42.

11 劉江云.桂枝的化學(xué)成分研究.中草藥，2002，33:681-683.

12 鄭輝.白芍總苷的抗風(fēng)濕藥理作用.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，18:520.

13 苗明三，孫麗敏.大棗的現(xiàn)代研究.河南中醫(yī)，2003，23:59-60

14 周運峰.大棗多糖抗氧化作用.中西醫(yī)結(jié)合，1997，(特刊):97-98.

15 崔振環(huán).復(fù)方大棗合劑對小鼠乳腺癌生長抑制作用的初步觀察.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999，5:15-16.

16 楊曉林，孫菊云，張淪.褐藻糖膠的有絲分裂原效應(yīng).中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1991，11:282-284.

17 莊茂辛，吳耀生，李曼玲.黃芪、黨參、人參多糖對豚鼠免疫功能的影響.中國藥學(xué)雜志，1992，27:653-655.