載神經(jīng)生長因子納米柔性脂質(zhì)體制備及穩(wěn)定性研究

管晨峰 路偉 張開禮 郭見 潘一峰 黃國棟

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)在損傷神經(jīng)再生和功能修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。然而，NGF難以通過血腦屏障，使其在給藥的途徑和方式上存在技術(shù)上的難題。納米柔性脂質(zhì)體具有高度的變形性，它能穿過直徑為其1/10的小孔。本研究采用薄膜-超聲法制備載NGF納米柔性脂質(zhì)體，并對制備條件和穩(wěn)定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠);WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);超聲破碎乳化儀;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠);Zetasizer激光粒度分析儀(英國馬爾文公司)。

1.2 主要試劑 葡聚糖凝膠G-50(上海伯奧生物科技有限公司);卵磷脂、膽固醇、膽酸鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);NGF(廈門北大之路生物工程有限公司)。

1.3 載NGF納米柔性脂質(zhì)體的制備 定量稱取卵磷脂、膽固醇、NGF于圓底燒瓶中，加入10 ml氯仿-甲醇復(fù)合溶劑于混合儀上充分溶解后，于37℃恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)去除有機溶劑，形成均勻類脂薄膜，以氮氣吹干殘余溶劑。再加入含有定量膽酸鈉的水和介質(zhì)溶液10 ml至燒瓶中，旋轉(zhuǎn)洗膜1 h，使脂質(zhì)膜充分溶脹水化，得到脂質(zhì)體混懸液。將上述脂質(zhì)體混懸液置于冰水浴中探針式間斷超聲，室溫靜置后用0.2 μm微孔濾膜過濾除去超聲時探頭所釋放的金屬顆粒等雜質(zhì)。氮氣密封，4℃冷藏保存。

1.4 載NGF納米柔性脂質(zhì)體包封率測定 取適量的載NGF納米柔性脂質(zhì)體，加5%Tri-ton X-100乙醇溶液2 ml破乳，再加入5 ml磷酸鹽緩沖液充分混勻，萃取，靜置，Elissa法測定NGF含量。包封率=總NGF量-游離NGF量/總NGF量×100%。

1.5 載NGF納米柔性脂質(zhì)體粒徑檢測 加樣槍吸取適量脂質(zhì)體樣品溶液，注入到激光粒度分析儀的石英測量池和毛細管小池中，進行粒徑檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 制備溫度的影響 在20～50℃范圍對制備溫度進行了篩選。結(jié)果表明，30℃時，制備的納米脂質(zhì)體包封率最高。見表1。

表1 制備溫度對包封率的影響±s

表1 制備溫度對包封率的影響±s

20℃30℃40℃50℃包封率(%)40.24±0.2261.52±0.4354.26±0.4633.52±0.27項目

2.2 pH值對包封率的影響 配制pH值分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的緩沖液，以它們作為水相介質(zhì)，制備載NGF納米柔性脂質(zhì)體。pH值為7.0時，制備的納米脂質(zhì)體包封率最高。見表2。

表2 pH值對包封率的影響±s

表2 pH值對包封率的影響±s

8.0包封率(%)37.04±0.4441.26±0.3760.13±0.62 50.14±0.4項目pH值6.0pH值6.5pH值7.0pH值7.5pH值932.71±0.68

2.3 磷脂濃度對包封率的影響 考察磷脂的濃度分別為20、30、40、50 mg/ml時，磷脂濃度對藥物包封率的影響。磷脂濃度對藥物的包封率影響較大。磷脂濃度增加，包封率上升，當(dāng)磷脂濃度達到40 mg/ml時，包封率變化不多。見表3。

表3 磷脂濃度對包封率的影響±s

表3 磷脂濃度對包封率的影響±s

20 mg/ml30 mg/ml40 mg/ml50 mg/ml包封率(%)23.61±0.1442.30±0.6357.86±0.7260.05±0.67項目

2.4 膽固醇與磷脂的比例對包封率的影響NGF藥量固定，改變膽固醇的濃度，使膽固醇與磷脂的比例為1∶10，1∶8，1∶6，1∶4，1∶2。隨著膽固醇濃度的增加，包封率也相應(yīng)的增加，當(dāng)比值達到1∶4時，包封率趨于穩(wěn)定。見表4。

表4 膽固醇與磷脂的比例對包封率的影響±s

表4 膽固醇與磷脂的比例對包封率的影響±s

1∶2包封率(%)22.16±0.2035.36±0.2540.72±0.5462.02±0.6項目 膽固醇與磷脂比1∶10膽固醇與磷脂比1∶8膽固醇與磷脂比1∶6膽固醇與磷脂比1∶4膽固醇與磷脂比365.30±0.62

2.5 載NGF納米柔性脂質(zhì)體穩(wěn)定性觀測 在室溫條件下，30 d內(nèi)載NGF納米柔性脂質(zhì)平均粒徑無顯著改變。同時，在4℃冰箱條件下保存12個月，上述指標的檢測結(jié)果與保存前相似。見表5。

表5 載NGF納米柔性脂質(zhì)體穩(wěn)定性觀測±s

表5 載NGF納米柔性脂質(zhì)體穩(wěn)定性觀測±s

室溫4℃下保存時間(月)項目12平均粒徑(nm)64.31±0.8362.17±0.6460.64±0.7264.3±0.83 0 d15 d30 d 06 59.58±0.4958.72±0.56

3 討論

NGF作為現(xiàn)在臨床上應(yīng)用比較普遍的體液調(diào)節(jié)因子之一，廣泛的分布于中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中。它通過促進神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，維持神經(jīng)元的生長、存活、分化，并影響突觸的可塑性。病理狀態(tài)下，NGF可抑制神經(jīng)元的死亡，加強自由基的清除，促進神經(jīng)元功能的恢復(fù)，達到保護神經(jīng)元的目的。然而，由于NGF屬大分子蛋白質(zhì)，正常情況下難以通過血腦屏障，限制其臨床應(yīng)用［1-4］。

柔性脂質(zhì)體是指在脂質(zhì)體的雙分子層中加入不同的柔軟劑使脂質(zhì)體具有優(yōu)越的柔順性和變形性，易于攜帶藥物通過微孔道，而且，柔性脂質(zhì)體對藥物的包封率高于普通脂質(zhì)體，其穩(wěn)定性也遠遠大于普通脂質(zhì)體。納米級的柔性脂質(zhì)體則具有更高的穿透效率［5-9］。

影響脂質(zhì)體中藥物包封率有多種因素，如:溫度、溶液pH、磷脂濃度、膽固醇與磷脂的比例等，本文較系統(tǒng)地考察了各影響因素對神經(jīng)生長因子納米柔性脂質(zhì)體包封率的影響及其穩(wěn)定性。

試驗結(jié)果表明，制備載NGF納米柔性脂質(zhì)體的最適溫度為30℃;pH值為7.0時，制備的納米脂質(zhì)體包封率最高。磷脂濃度增加，包封率上升，適宜濃度為40 mg/ml;磷脂與膽固醇相互間隔定向排列，形成雙分子層，是共同構(gòu)成脂質(zhì)體的基礎(chǔ)物質(zhì)，本文的研究顯示，膽固醇與磷脂適宜比例為1∶4。

對載NGF納米柔性脂質(zhì)體穩(wěn)定性的研究表明，其性質(zhì)穩(wěn)定，室溫保存30 d、4℃冰箱12個月，其粒徑無明顯變化。

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