核苷代謝對(duì)甲氨蝶呤治療骨破壞療效的影響研究

屈鵬飛 李浩波 陳彪 賈志宇 趙云轉(zhuǎn) 張睿 楊威 張英懷

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性的炎癥性疾病，其特征為破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)破壞和關(guān)節(jié)軟骨的破壞［1］。甲氨蝶呤(MTX)是一個(gè)單甲基的氨基蝶呤，近年來(lái)被廣泛地使用，是最有效的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床藥物之一。甲氨蝶呤和氨基蝶呤由于能夠通過(guò)抑制一種控制核酸合成的酶(二氫葉酸還原酶)來(lái)抑制DNA合成，因此在抗腫瘤的方面，也有著非常顯著的藥效［2］。近年來(lái)在對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者治療過(guò)程中，低劑量的甲氨蝶呤被廣泛的用來(lái)抑制關(guān)節(jié)炎癥［3］，但是最近的研究表明，甲氨蝶呤在一些類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療過(guò)程中，出現(xiàn)了效果不良，并且可能是因?yàn)榻o藥過(guò)程中，因?yàn)槠滢卓箘┑臐撛诳赡埽鴮?dǎo)致了效能極大降低［4，5］。本研究主要是在大鼠的全骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)體系中脫氧腺苷與甲氨蝶呤的拮抗現(xiàn)象和在佐劑引導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邢佘彰摪泵杆降淖兓瘉?lái)初步研究甲氨蝶呤對(duì)腺苷脫氨酶的抑制現(xiàn)象，并通過(guò)目前的證據(jù)發(fā)現(xiàn)腺苷脫氨酶可能為甲氨蝶呤的一個(gè)分子靶，并以此來(lái)解釋在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療過(guò)程中，造成甲氨蝶呤治療效果不良的形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡SD雄性大鼠(清潔級(jí)，體重100～120 g)和5周齡雌性Lewis大鼠(清潔級(jí)，體重100～120 g)，由九動(dòng)株式會(huì)社(鳥棲，日本)提供，所有的動(dòng)物試驗(yàn)都是根據(jù)九州大學(xué)制定的護(hù)理和使用動(dòng)物指南而進(jìn)行的。

1.2 主要試劑及儀器 α-Minimum Essential Medium(αMEM;cat#12000-022)胎牛血清和青霉素購(gòu)于Invitrogen公司(大島，紐約)。1，25-(OH)2D3購(gòu)于英國(guó)普利茅斯生物研究實(shí)驗(yàn)室。腺苷脫氨酶抗體(H-300):SC-25747購(gòu)于圣克魯斯生物技術(shù)(美國(guó)加利福尼亞州圣克魯斯)。第二抗體:Alexa Fluor?488 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)和(ECL)試劑盒購(gòu)于Technologies Corporation(東京，日本)。甲氨蝶呤，脫氧核苷和免疫染色試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Kat1表面抗體由九州大學(xué)口腔分子解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 骨髓培養(yǎng)系統(tǒng) 全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系(破骨細(xì)胞形成系):將4周齡SD雄性大鼠用異氟烷麻醉后，無(wú)菌條件下取其脛骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔，然后用25號(hào)注射針沖出全骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，用24孔培養(yǎng)板(1×106cells/孔)或10 cm培養(yǎng)皿(3.85×106cells/皿)，在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含15%FBS的α-MEM培養(yǎng)液。其中要添加1α，25-二羥維生素D3的濃度為10-8mol(V/V)，加熱處理ROS17/2.8細(xì)胞培養(yǎng)基(HT-ROS CM)濃度為10%。培養(yǎng)4或5 d后，進(jìn)行Kat1免疫染色，其中含有3個(gè)以上的核的Kat1陽(yáng)性細(xì)胞作為破骨細(xì)胞樣多核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 免疫染色 全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，用α-MEM培養(yǎng)液沖洗兩次:(1)一抗:每孔加入1/100的Kat1抗體(10 μg/ml)200 μl。(2)于37℃培養(yǎng)30 min后，PBS沖洗3次，4%的甲醛溶液固定20 min。(3)用PBS洗4次，加入3%羊血清，室溫靜置30 min。(4)二抗:移除羊血清，直接加入生物素基化抗體小鼠IgM，室溫靜置30 min。(5)用PBS清洗6次后，加入發(fā)光劑ABCAP(30 min前預(yù)制)，遮光室溫放置30 min。(6)用PBS清洗6次，然后加入CDR(溶于0.1 mol/L Tris-Hcl緩沖液的1 mmol/L左旋咪唑)，遮光室溫放置30 min后，用PBS沖洗3次，加入5%的戊二醛，再靜置30 min。(7)蒸餾水清洗4次，室溫下干燥后，高倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，細(xì)胞核超過(guò)3個(gè)的染色陽(yáng)性細(xì)胞為破骨細(xì)胞。

1.5 關(guān)于Lewis大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)對(duì)象:12只5周齡雌性Lewis大鼠被分為3組。(1)第1組(對(duì)照組):大鼠尾根部行皮下單獨(dú)注射礦物油，0.5 ml/只。(2)第2組(關(guān)節(jié)炎組):①大鼠尾根部行皮下注射弗氏佐劑(CFA)為25 mg/kg熱滅活M.酪酸;并以礦物油作注射介質(zhì);②同時(shí)用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)行腹腔注射，腹腔注射于佐劑皮下注射后第3天開始，1次/周。(3)第3組(治療組):①首先與關(guān)節(jié)炎組一樣在大鼠尾根部行皮下注射弗氏佐劑(CFA)為25 mg/kg并以礦物油作注射介質(zhì);②同時(shí)以甲氨蝶呤(1 mg·kg-1·周-1)行腹腔注射，腹腔注射于佐劑皮下注射后第3天開始，1次/周。4周后，所有的后踝關(guān)節(jié)(含有脛骨遠(yuǎn)端和距骨)被用來(lái)制作石蠟切片并行免疫熒光染色。

1.6 免疫熒光染色(1)石蠟切片(6 μm)脫蠟后，先用10%山羊血清于室溫下進(jìn)行封閉60分鐘。(2)切片用(H-300)抗-ADA多克隆抗體(H-300，抗體需用1%山羊血清1∶200稀釋)孵育，并置于4℃的濕盒內(nèi)過(guò)夜。(3)切片用PBS清洗6次后，加入與Alexa熒光?488聯(lián)結(jié)的第二抗體goat anti-rabbit IgG(H+L)(A11034，抗體需用1%山羊血清1∶500稀釋)，暗室內(nèi)室溫下放置60 min。(4)PBS漂洗后，即可用熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 在全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系(破骨細(xì)胞形成系)中，脫氧腺苷廢除了甲氨蝶呤對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用。在全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系中，甲氨蝶呤顯著的抑制了破骨細(xì)胞特異性抗體Kat1免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞的生成，但是這種抑制作用卻隨著脫氧腺苷的添加而逐漸地消失了，并且呈一定的劑量依賴關(guān)系。見圖1、表1。

圖1 大鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)4 d后，破骨細(xì)胞特異性抗體Kat1光鏡圖像(免疫熒光×20)

表1 甲氨蝶呤和脫氧核苷對(duì)破骨細(xì)胞生成影響n=4，±s

表1 甲氨蝶呤和脫氧核苷對(duì)破骨細(xì)胞生成影響n=4，±s

注:甲氨蝶呤(1 μmol)比較，*P＜0.01

組別Kat1免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)P值對(duì)照組49.00±2.16*0.000567甲氨蝶呤(1 μmol)2.75±1.55甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(1 μmol)0.75±0.750.382204甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(10 μmol)6.50±1.190.072334甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(100 μmol)57.50±3.18*0.001097甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(200 μmol)80.00±6.54*0.000519

2.2 在佐劑引導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，甲氨蝶呤抑制了腺苷脫氨酶水平的表達(dá)。腺苷脫氨酶在罹患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的骨關(guān)節(jié)切面上高度表達(dá)，而在對(duì)照組的骨標(biāo)本切面上的表達(dá)比較低。腺苷脫氨酶高度表達(dá)于骨髓細(xì)胞和骨細(xì)胞外的骨破壞區(qū)域，并導(dǎo)致一定的彌漫性強(qiáng)染色模式。而經(jīng)過(guò)甲氨蝶呤注射的罹患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠標(biāo)本中，腺苷脫氨酶被明顯抑制。見圖2、3。

圖2 后踝關(guān)節(jié)的免疫熒光染色，Ti:脛骨，Ta:距骨，標(biāo)尺:50 μm

圖3 關(guān)節(jié)炎大鼠距骨的骨髓位置中ADA免疫染色最強(qiáng)烈的部位，B:骨組織，BM:骨髓，圖標(biāo)尺:50 μm

3 討論

目前從許多類風(fēng)濕性病例來(lái)看，甲氨蝶呤能夠抑制骨關(guān)節(jié)滑膜表面的炎性細(xì)胞的大量增殖［6］，然而關(guān)于甲氨蝶呤如何調(diào)節(jié)炎性骨破壞所作用的分子靶點(diǎn)仍然還是不清楚。據(jù)報(bào)道，腺苷能夠廢除甲蝶呤對(duì)破骨細(xì)胞的形成的抑制以及對(duì)炎癥性骨破壞關(guān)節(jié)炎的治療結(jié)果［7］。而腺苷脫氨酶(ADA)是體內(nèi)調(diào)節(jié)腺苷和脫氨腺苷代謝的關(guān)鍵酶，它不僅僅降解細(xì)胞內(nèi)的腺苷而且也負(fù)責(zé)降解能夠引起淋巴細(xì)胞毒性細(xì)胞外腺苷［8］。

腺苷和脫氧腺苷在細(xì)胞外主要來(lái)源于凋亡細(xì)胞DNA的降解，在細(xì)胞內(nèi)主要來(lái)源于生理的核酸合成。這些核苷和脫氧核苷在體內(nèi)又被磷酸化而用來(lái)合成ATP或脫氧ATP并被利用合成DNA。而腺苷脫氨酶(ADA)是存在于體內(nèi)主要來(lái)降解腺苷和脫氧腺苷的關(guān)鍵酶。而據(jù)最近的文獻(xiàn)報(bào)道:由于基因突變導(dǎo)致腺苷脫氨酶的先天性缺乏，會(huì)引起嚴(yán)重的基因缺陷性疾病。抑制腺苷脫氨酶會(huì)引起細(xì)胞外腺苷和脫氧腺苷濃度的增高，尤其是脫氧腺苷濃度異常增高，從而會(huì)影響DNA的合成［9］。據(jù)臨床報(bào)道，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中，腺苷脫氨酶的濃度比正常人要高很多［10］。目前的數(shù)據(jù)表明:(1)在全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系(破骨細(xì)胞形成系)中，脫氧腺苷廢除了甲氨蝶呤對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)關(guān)系。(2)甲氨蝶呤抑制了罹患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)腺苷脫氨酶的水平的表達(dá)。所以我們可以推測(cè)由于甲氨蝶呤的參與，在骨關(guān)節(jié)患者的局部病灶(例如某些風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液)內(nèi)的腺苷脫氨酶有可能被抑制，從而導(dǎo)致了細(xì)胞外腺苷和脫氧腺苷濃度的增高，尤其是脫氧腺苷濃度異常增高。但是由于脫氧腺苷能夠有效的拮抗甲氨蝶呤對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用，所以最后造成甲氨蝶呤臨床效能大大的降低。近年來(lái)，目前對(duì)腺苷的細(xì)胞表面受體的研究很多，結(jié)合目前的數(shù)據(jù)，腺苷和脫氧核苷表面受體的拮抗劑的引入和對(duì)腺苷脫氨酶生理學(xué)方面的進(jìn)一步探索有能成為未來(lái)潛在的治療手段。

1 Shimizu S，Shiozawa S，Shiozawa K，et al.Quantitative histologic studies on the pathogenesis of periarticular osteoporosis in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum，1985，28:25-31.

2 Farber S，Diamond LK.Temporary remissions in acute leukemia in children produced by folic acid antagonist，4-aminopteroyl-glutamic acid.N Engl J Med，1948，238:787-793.

3 Weinblatt ME，Coblyn JS，F(xiàn)ox DA，et al.Efficacy of low-dose methotrexate in rheumatoid arthritis.N Engl J Med，1985，312:818-822.

4 Choi HK，Seeger JD，Kuntz KM.A cost-effectiveness analysis of treatment options for patients with methotrexate-resistant rheumatoid arthritis.Arth Rheumat，2000，43:2316-2327.

5 Barbieri M，Wong JB，Drummond M.The cost effectiveness of infliximab for severe treatment-resistant rheumatoid arthritis in the UK.Pharmacoeconomics，2005，23:607-618.

6 Romas E，Gillespie MT.Inflammation-induced bone loss:can it be prevented?Rheum Dis Clin North Am，2006，32:759-773.

7 Teramachi J，Kukita A，Li YJ，et al.Adenosine abolishes MTX-induced suppression of osteoclastogenesis and inflammatory bone destruction in adjuvant-induced arthritis.Lab Invest，91:719-731.

8 Blackburn MR，Aldrich M，Volmer JB，et al.The use of enzyme therapy to regulate the metabolic and phenotypic consequences of adenosine deaminase deficiency in mice.Differential impact on pulmonary and immunologic abnormalities.J Biol Chem，2000，275:32114-32121.

9 Benveniste P，Zhu W，Cohen A.Interference with thymocyte differentiation by an inhibitor of S-adenosylhomocysteine hydrolase.J Immunol，1995，155:536-544.

10 Erer B，Yilmaz G，Yilmaz FM，et al.Assessment of adenosine deaminase levels in rheumatoid arthritis patients receiving anti-TNF-alpha therapy.Rheumatol Int，2009，29:651-654.