羊膜在眼科領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展

馮蕭蕭(綜述)，劉 海(審校)

(云南省第二人民醫(yī)院眼科中心，昆明 650000)

羊膜從細(xì)胞滋養(yǎng)層演化而來，是人類兩層胎膜的內(nèi)層，為人體中最厚的基膜。自1910年，Divis首次把胎膜(羊膜+絨毛膜)用于移植取得成功后，羊膜被廣泛用于醫(yī)學(xué)臨床研究中。隨后，Kim等[1]在化學(xué)燒傷模型的角膜表面成功進(jìn)行羊膜移植，羊膜對重建眼表的作用逐漸引起眼科醫(yī)師的重視?，F(xiàn)今成熟的現(xiàn)代化組織制備技術(shù)使羊膜的材料性能得到不斷地提高和改善，羊膜的開發(fā)和應(yīng)用也不斷向前發(fā)展。尤其在眼科的應(yīng)用中，羊膜不僅局限于作為組織移植材料，也被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)載體、分子生物篩、膜控釋藥系統(tǒng)等基礎(chǔ)研究中。

1 羊膜的生物特性

1.1羊膜的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 肉眼下羊膜薄而透明。光鏡下羊膜自外向內(nèi)分為5層[2]：上皮細(xì)胞層、基膜、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層。①上皮細(xì)胞層：為單層立方上皮，有合成、分泌和沉積基膜和細(xì)胞外間質(zhì)成分的能力。②基膜：由網(wǎng)狀纖維構(gòu)成，含Ⅳ形膠原纖維網(wǎng)，層粘連蛋白和硫肝糖蛋白等。③致密層：由網(wǎng)織纖維組成，與基膜緊密聯(lián)接，決定了羊膜的張力能力。④纖維母細(xì)胞層，由纖維母細(xì)胞及網(wǎng)狀纖維組成，是組成羊膜厚度的主要部分。⑤海綿層，由波浪狀的網(wǎng)狀纖維束組成，具有伸展性。電鏡下，羊膜上皮細(xì)胞外側(cè)面有大量微絨毛結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞間由橋粒和半橋粒相連，形成復(fù)雜的迷路型管道系統(tǒng)，基膜上的半橋粒結(jié)構(gòu)非常豐富，含有微纖維[3-4]。目前臨床上所用的羊膜植片通常只含有上皮細(xì)胞層、基底層和致密層結(jié)構(gòu)。

1.2羊膜的免疫特點(diǎn)

1.2.1羊膜的低抗原性 Adinolfi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，羊膜不表達(dá)人類白細(xì)胞抗原Ⅱ(human leucotyte antigenⅡ，HLA-Ⅱ)類抗原，含少量的人類白細(xì)胞抗原(HLA-A,B,C)和人類白細(xì)胞抗原-DR(HLA-DR)抗原以及B9-微球蛋白，抗原性極低。Kubo等[6]對凍存羊膜的免疫原性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在異種移植中，羊膜在免疫赦免組織內(nèi)不引起排斥反應(yīng)，而在非免疫赦免組織中僅具有相對的免疫原性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)羊膜具有能在體外抑制免疫活性的Fas配體陽性細(xì)胞，說明羊膜具有減少免疫細(xì)胞來源、避免免疫排斥反應(yīng)的作用。華萍等[7]通過建立BALB/c小鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分析外周血CD3+、CD25+和CD3+、CD21+表達(dá)水平及免疫組織化學(xué)法定量監(jiān)測組織切片中CD3+、CD4+、CD8+、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ的表達(dá)水平，得出凍干羊膜和新鮮羊膜行體內(nèi)移植后，均表現(xiàn)出極低的免疫原性，不會引起由T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性排斥反應(yīng)，具有良好的組織相容性。

1.2.2羊膜可分泌大量細(xì)胞因子 Imakawa等[8]研究發(fā)現(xiàn)，羊膜可分泌大量的細(xì)胞因子，如表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子(神經(jīng)營養(yǎng)素、神經(jīng)細(xì)胞分裂素、成纖維細(xì)胞生長因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子等)、轉(zhuǎn)化生長因子β(轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2、轉(zhuǎn)化生長因子β3)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子等及其相應(yīng)的信使RNA等成分。Hao等[9]通過反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，羊膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)多種抗血管形成因子和抗炎蛋白，包括白細(xì)胞介素1受體、白細(xì)胞介素10、內(nèi)皮抑制素前體蛋白，金屬蛋白酶組織抑制因子和血小板反應(yīng)蛋白1等，這些因子作用于眼部可釋放各種抗炎和抗血管因子。

2 羊膜在眼科領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1羊膜手術(shù) 在眼科臨床中，羊膜主要作為生物基膜進(jìn)行移植。根據(jù)手術(shù)目的及所希望達(dá)到的治療效果羊膜手術(shù)大致可分為羊膜移植術(shù)、羊膜遮蓋術(shù)及羊膜充填術(shù)。羊膜移植術(shù)的主要目的是使急性損傷的角膜眼表或缺損的結(jié)膜區(qū)能夠迅速上皮化，如眼表化學(xué)性燒傷及眼表熱燒傷[10]、Steven-Johnson綜合征[11]、神經(jīng)麻痹性角膜病變[12]和準(zhǔn)分子激光屈光性角膜手術(shù)后角膜受損[13-14]、眼表腫瘤[15]等。羊膜遮蓋術(shù)主要應(yīng)用于治療瞼球粘連[16]等大面積的眼表病變，目的是維持眼表穩(wěn)定，重建眼表結(jié)構(gòu)；羊膜充填術(shù)則多應(yīng)用于眼肌損傷的修復(fù)[17]、非感染性角膜及鞏膜的潰瘍或穿孔[18]及難治性青光眼術(shù)后濾過口的粘連[19]等。

2.2羊膜可作為細(xì)胞培養(yǎng)的載體 羊膜上帶有活性細(xì)胞，并可分泌多種細(xì)胞因子，使其成為一種理想的支持細(xì)胞生長的載體。Dobrowolski等[20]將羊膜作為載體進(jìn)行角膜緣上皮細(xì)胞的自體培養(yǎng)，并進(jìn)行移植，初步取得滿意效果。Fan等[21]采用去除自身上皮細(xì)胞的羊膜基膜作為培養(yǎng)載體，種植非轉(zhuǎn)染人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增的方法成功培育出具有活性的角膜內(nèi)皮細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)證明，羊膜基膜是角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長和移植的良好載體，體外培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植有望替代供體角膜移植，具有廣闊的應(yīng)用前景。Akrami等[22]以羊膜作為培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，通過檢測多種細(xì)胞因子及基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)羊膜可選擇性地作為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)的載體。

2.3羊膜細(xì)胞可被體外誘導(dǎo)分化 人羊膜上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的性質(zhì)，擁有和胚胎干細(xì)胞同樣的表面標(biāo)記蛋白，也擁有Oct-4和Nanog基因，是角膜組織工程的理想“種子細(xì)胞”。張仁禮等[23]首先將小鼠胚胎干細(xì)胞與人羊膜共培養(yǎng)4～5 d，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞樣的單層細(xì)胞，結(jié)果顯示，人羊膜組織可在體外誘導(dǎo)分化為表皮樣干細(xì)胞。Fatimah等[24]將經(jīng)胰蛋白酶消化后的羊膜上皮細(xì)胞種植于含有多種細(xì)胞因子及誘導(dǎo)液的培養(yǎng)液中，經(jīng)連續(xù)傳代(4代)后發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞具有分化為角膜上皮細(xì)胞的潛能。周清等[25]和劉小勇等[26]利用角膜基質(zhì)作為載體誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化，得到了在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及在角膜上皮特異性表面標(biāo)志蛋白CK3/12的表達(dá)上均類似角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞，表明人羊膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)的調(diào)控下可向角膜上皮細(xì)胞分化。

2.4羊膜可作為眼科藥物的緩釋藥膜 羊膜是一種優(yōu)良的組織工程材料，Kim等[27]認(rèn)為羊膜可作為有效的藥物釋放系統(tǒng)，提高藥物在淚液中的質(zhì)量濃度。蔡明銘等[28]將更昔洛韋與纖維蛋白膠混合后與羊膜黏合，制成更昔洛韋-纖維蛋白膠-羊膜復(fù)合物，研究發(fā)現(xiàn)不論體內(nèi)或體外條件下，更昔洛韋-纖維蛋白膠-羊膜復(fù)合物均具有良好的緩釋特性，可成為治療病毒性角膜炎的新手段。周文君等[29]將纖維蛋白膠交聯(lián)羊膜和表皮生長因子/殼聚糖納米粒復(fù)合，構(gòu)建一種新型的無縫合、可移植同時(shí)能有效緩釋蛋白藥物的復(fù)合生物材料(rhEGF/CS-FBAM)，成功應(yīng)用于眼表創(chuàng)傷修復(fù)。李小丹等[30]將兩性霉素B脂質(zhì)體與纖維蛋白膠混合，再與羊膜膠聯(lián)，制備成兩性霉素B脂質(zhì)體膠聯(lián)羊膜的藥膜。將藥膜移植于兔眼表后，研究發(fā)現(xiàn)兩性霉素B脂質(zhì)體膠聯(lián)羊膜藥膜是一種較好的藥物緩釋系統(tǒng)。

2.5羊膜可與眾多生物材料共同構(gòu)建細(xì)胞/支架復(fù)合體 王馨[31]將人羊膜上皮細(xì)胞層和海綿層去除，將余下羊膜組織與自制的硝酸纖維素膜框架制成羊膜支架。研究發(fā)現(xiàn),所制作的羊膜支架貼合牢固，不會皺縮，可用于細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，還可以聯(lián)合皮膚表皮干細(xì)胞進(jìn)行眼表的重建。齊愛青[32]通過構(gòu)建大鼠羊膜上皮細(xì)胞與膠原海綿復(fù)合體，將其移入大鼠視神經(jīng)損傷模型中，發(fā)現(xiàn)復(fù)合體能發(fā)揮大鼠羊膜上皮細(xì)胞與膠原海綿的協(xié)同作用，改善視神經(jīng)軸突再生的局部微環(huán)境，增加視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活量，促進(jìn)視神經(jīng)軸突的再生。Chau等[33]將組織性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與人羊膜進(jìn)行交聯(lián)形成一種新的生物支架，體外研究發(fā)現(xiàn)，此種支架不僅能夠保持光學(xué)透明性，還能允許非免疫反應(yīng)的新生血管形成，為重建眼表結(jié)構(gòu)提供了新的治療方法。

3 小 結(jié)

羊膜以其復(fù)雜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，獨(dú)特的免疫學(xué)特性，在眼科領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。但目前羊膜的應(yīng)用仍存在諸多問題，羊膜中各種細(xì)胞因子在正常及異常眼各組織中如何發(fā)揮作用，如何促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，仍需進(jìn)一步深入研究。相信隨著技術(shù)的完善與改進(jìn)、對生物組織材料研究的進(jìn)一步發(fā)展、對羊膜研究的進(jìn)一步深入，各種適用于不同生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新型生物羊膜產(chǎn)品會研發(fā)出來。羊膜的應(yīng)用在眼科領(lǐng)域的發(fā)展會得到更加廣泛的體現(xiàn)。

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