施用不同生物有機(jī)肥對(duì)連作黃瓜枯萎病防治效果及其機(jī)理初探

袁玉娟， 胡 江， 凌 寧， 仇美華， 沈其榮， 楊興明*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京 210095； 2 南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇南通 226007)

利用優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥作為介質(zhì)，加入功能型拮抗菌進(jìn)行二次固體發(fā)酵，研發(fā)一種新型的生物有機(jī)肥(bio-organic fertilizer, BIO)。通過(guò)足量的有機(jī)物質(zhì)提供生防菌以足夠的營(yíng)養(yǎng)與能源物質(zhì)，幫助生防菌在土壤中定殖和繁殖，充分發(fā)揮生防菌促進(jìn)作物生長(zhǎng)和拮抗某些土傳病原微生物等作用。本試驗(yàn)通過(guò)施用菌株SQR9和T37二次固體發(fā)酵獲得的生物有機(jī)肥，采用營(yíng)養(yǎng)缽育苗方法檢驗(yàn)BIO控制連作障礙地黃瓜枯萎病及促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)的能力，并對(duì)二菌株在黃瓜根際的定殖情況進(jìn)行觀察，初步揭示了這兩株拮抗菌的生防機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 試驗(yàn)中所用的拮抗菌和病原菌均為本實(shí)驗(yàn)室篩選，其中拮抗真菌為哈茨木霉屬(Trichodermaharzianum) T37、 拮抗細(xì)菌為枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)SQR9以及菌株SQR9的GFP標(biāo)記菌株SQR9-G。病原菌為尖孢鐮刀菌黃瓜專(zhuān)化型(FOC)。

1.1.3 黃瓜品種 “津春4號(hào)”(天津黃瓜研究所)。

1.1.4 供試土壤和肥料 營(yíng)養(yǎng)缽育苗土壤為未種植過(guò)黃瓜的健康水稻土；大盆土壤為黃瓜枯萎病發(fā)病土壤(采自江蘇徐州銅山縣)。供試微生物有機(jī)肥(本實(shí)驗(yàn)室自行研制)為氨基酸有機(jī)肥料和豬糞按1 ∶1比例混合發(fā)酵而成。氨基酸有機(jī)肥料含有機(jī)質(zhì)44.2%、 氨基酸8.0%、 N 4.4%、 P2O52.3%、 K2O 0.67%和水分28.5%；豬糞堆肥含有機(jī)質(zhì)30.4%、 N 2.01%、 P2O53.7%、 K2O 1.1%和水分28.5%。

1.2 盆栽試驗(yàn)

1.2.2 黃瓜種子準(zhǔn)備 黃瓜種子用0.02%的氯化汞消毒5分鐘，無(wú)菌水沖洗三次，放置在無(wú)菌的紗布中30℃催芽。

盆栽試驗(yàn)處理： 1) CK (CK營(yíng)養(yǎng)缽+CK盆缽)；2) OF (OF營(yíng)養(yǎng)缽+OF盆缽)；3) BIOⅠ(BIOⅠ營(yíng)養(yǎng)缽+ BIOⅠ盆缽)；4) BIOⅡ (BIOⅡ營(yíng)養(yǎng)缽+ BIOⅡ盆缽)；5) BIOⅢ(BIOⅢ營(yíng)養(yǎng)缽+ BIOⅢ盆缽)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 黃瓜移苗后，早晚觀察記錄植株生長(zhǎng)狀況。每隔20 d取樣，分別取根際土和土體土進(jìn)行分析。每天記錄發(fā)病的植株數(shù)量，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)計(jì)算累積發(fā)病率。發(fā)病率(%)=發(fā)病株數(shù)/(發(fā)病株數(shù)+健康株數(shù))×100[8]

1.2.5 計(jì)算黃瓜根際土中FOC的數(shù)量 在試驗(yàn)結(jié)束前，采用real-time PCR的方法檢測(cè)根際土中病原菌FOC的數(shù)量。每個(gè)處理隨機(jī)抽取5個(gè)盆缽，采集黃瓜根際土樣。將黃瓜的根輕輕地剝離出來(lái)，抖動(dòng)植株的根，大的土壤顆粒被抖落，將粘結(jié)比較緊密的土壤從植物的根上剝落收集起來(lái)作為黃瓜的根際土。熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系[9]為25μL，SYBR? Premix ExTaqTM(2×) (TakaRa) 混合液13 μL，上下游引物各0. 5 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水9 μL。熒光定量PCR 擴(kuò)增條件[9]： 95℃ 2 min，94℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3 生防菌SQR9和T37的根表定殖能力測(cè)定

1.3.1 菌液制備 SQR9-G菌液制備： 取-70℃保存的SQR9菌液在LB固體加卡納霉素的抗性平板上活化，取單菌落接種于3 mL LB加卡納霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。再以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL LB加卡納霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃、 170 r/min震蕩培養(yǎng)24 h。細(xì)菌終濃度為7.3×109cfu/mL。

T37菌液制備： 接種木霉菌株T37于PDA斜面培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)，進(jìn)行菌種活化。取培養(yǎng)好的木霉菌斜面，加入適量無(wú)菌水，刮下分生孢子打散，倒入滅菌的三角瓶中，制成1×107個(gè)cfu/mL浮液，作為接種物。按0.5%的比例接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25℃、 130 r/min震蕩培養(yǎng)6 d。然后將成熟種子接種至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，25℃、 180 r/min震蕩培養(yǎng)10 d。孢子終濃度為8.2×108cfu/mL。

1.3.2 定殖試驗(yàn)[7]SQR9-G定殖試驗(yàn)： 無(wú)菌條件下，在無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中加入0.5 mL菌液，將催芽后的黃瓜種子置于培養(yǎng)基中，15 d后收集黃瓜植株根系制片，分別在熒光顯微鏡和電鏡下進(jìn)行觀察。

T37定殖試驗(yàn)： 采用蛭石，加入10 mL菌液，再將催芽后的黃瓜種子置于蛭石中，定時(shí)定量澆水，然后15 d取黃瓜植株根系制片，在電鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)黃瓜枯萎病發(fā)病率的影響

在黃瓜移植后62 d，各處理的發(fā)病率見(jiàn)圖1。CK發(fā)病率達(dá)到100%，施用沒(méi)有拮抗菌強(qiáng)化的有機(jī)肥處理(OF)發(fā)病率為88.2%，單獨(dú)采用菌株SQR9強(qiáng)化的處理BIOⅠ發(fā)病率達(dá)到51.0%，而單獨(dú)采用哈茨木霉T37強(qiáng)化的處理BIOⅡ和兩個(gè)菌株一起強(qiáng)化的處理BIOⅢ，可以將發(fā)病率控制在19.6%和13.7%。該結(jié)果表明，哈茨木霉T37較枯草芽孢桿菌SQR9能更好地防治黃瓜枯萎病，尤其是施用兩個(gè)功能菌一起強(qiáng)化的生物有機(jī)肥效果更顯著。

2.2 不同處理對(duì)黃瓜干重的影響

不同有機(jī)肥處理對(duì)黃瓜的生物量的影響如圖2所示，與CK和OF相比，處理BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ的黃瓜干重有顯著的提高；處理OF、 BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ的黃瓜干重分別比CK增加了52%、 155%、 146%和158%。BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ表現(xiàn)出了良好的促生能力，SQR9單獨(dú)強(qiáng)化的BIOⅠ略高于T37單獨(dú)強(qiáng)化的BIOⅡ，而經(jīng)SQR9和T37共同強(qiáng)化的BIOⅢ并沒(méi)有顯示出比BIOⅠ或BIOⅡ顯著的促生效果。

圖1 不同處理對(duì)黃瓜發(fā)病率的影響Fig.1 Effect of different treatments on the Fusarium wilt incidence of the cucumber plants[注(Note)： 柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)Different letters above the bar mean significant differences at the 0.05 level.]

圖2 不同處理對(duì)黃瓜干重的影響Fig.2 Effect of different treatments on the dry weight of the cucumber plants[注(Note)： 柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)Different letters above the bar mean significant differences at the 0.05 level.]

2.3 不同處理對(duì)植株高度的影響

從植株的生長(zhǎng)高度來(lái)看，不同處理也存在顯著差異(圖3)。處理OF、 BIOⅠ、 BIOⅡ和BIOⅢ的地上部株高分別為CK的1.44、 2.20、 2.18和2.53倍；處理BIOⅠ和BIOⅢ的地下部高度較CK分別增加了0.55和1.20倍，而CK、 OF和BIOⅡ間差異不顯著。結(jié)果表明，施用BIOⅠ和BIOⅢ能顯著促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

2.4 不同處理對(duì)尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

尖孢鐮刀菌黃瓜專(zhuān)化型是黃瓜枯萎病的致病菌，土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量直接影響到枯萎病的發(fā)病情況。由表1可以看出連作土壤中病原菌達(dá)到×107copies/g，土，施用普通有機(jī)肥能使病原菌的數(shù)量降低一個(gè)數(shù)量級(jí)左右，約為×106copies/g，土，施用BIOⅠ土壤中病原菌為×105copies/g，土；而B(niǎo)IOⅡ和BIOⅢ處理能顯著降低土壤中病原菌的數(shù)量，均降低到×103copies/g，土。

表1 不同處理對(duì)黃瓜根際尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響Table 1 Effect of different treatment on numbers of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum in cucumber rhizosphere

注(Note): 數(shù)值后小寫(xiě)字母表示處理間達(dá)5%顯著水平 Values followed by small letters mean significant differences atP<0. 05.

2.5 菌株SQR9根際定殖

為了更好地了解枯草芽孢桿菌SQR9在黃瓜根系的行為，我們采用GFP標(biāo)記的SQR9-G，研究了該菌株在黃瓜根際的定殖情況。培養(yǎng)15 d后，圖4-A為熒光顯微鏡拍攝的圖片，由圖片可清晰地觀察到黃瓜根表附著大量的SQR9-G，并在根表形成大量菌斑；圖4-B為電鏡拍攝的圖片，同樣能夠反映該菌體在黃瓜根系有效定殖，在根表形成生物膜。拮抗菌在植物根系的定殖是其實(shí)現(xiàn)預(yù)定的生防效果的保證，而SQR9在黃瓜根系良好的定殖情況，是解釋其促進(jìn)植物生長(zhǎng)、 抑制病原菌數(shù)量的機(jī)理之一。

2.6 生防木霉T37根際定殖

培養(yǎng)15 d后，由圖5-A掃描電子顯微鏡拍攝的圖片，可以清晰地看到T37的菌絲附著在黃瓜根表，并產(chǎn)生了大量的附著胞子。冷凍處理后可以更清晰地觀察到T37纏繞在黃瓜根表(圖5-B)。

3 討論

枯草芽抱桿菌通過(guò)成功定殖至植物根際、 體表或體內(nèi)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)植物周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)，分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達(dá)到生防的目的[10]。木霉菌對(duì)植物病原真菌的拮抗作用包含多種機(jī)制,一般認(rèn)為有競(jìng)爭(zhēng)作用、 重寄生作用及抗生作用[11]。國(guó)內(nèi)外很多研究同時(shí)證明，枯草芽孢桿菌[12-14]和木霉[15-17]不僅能防治土傳病害，而且還能作為促生菌來(lái)促進(jìn)作物生長(zhǎng)。本研究中使用了本實(shí)驗(yàn)室篩選的兩株高效拮抗菌株(枯草芽孢桿菌SQR9和哈茨木霉T37)，比較了單一菌株和復(fù)合菌株復(fù)合有機(jī)肥制成的幾種不同生物有機(jī)肥防治土傳黃瓜枯萎病的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)施用經(jīng)單一菌株(SQR9或T37)或混合菌株制成的生物有機(jī)肥料都能夠有效地控制連作障礙地黃瓜枯萎病，其中復(fù)合菌株制成的生物有機(jī)肥(BIOⅢ)能將發(fā)病率控制在13.7%(圖1)。從生物量看(圖2)，施用BIO處理的植株，生物量顯著高于CK和OF處理，相對(duì)于CK處理，BIOⅢ處理提高了1.5倍。這說(shuō)明SQR9和T37對(duì)黃瓜的生長(zhǎng)都有一定的促進(jìn)作用。另外，從植株高度看，施用BIO處理的植株，無(wú)論是地上部還是地下部，都顯著高于CK和OF處理。結(jié)果證明，SQR9和T37都能夠有效促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)。較BIOⅡ處理，BIOⅠ和BIOⅢ處理無(wú)論是地上部還是地下部的植株高度都有相對(duì)的提高，其原因可能是枯草芽孢桿菌SQR9相對(duì)于木霉T37更能夠促進(jìn)黃瓜作物的生長(zhǎng)。

單一的菌株制劑[18-21]或者純有機(jī)肥產(chǎn)品[22-25]對(duì)連作土壤中枯萎病的防治效果都很有限。本研究采用拮抗菌菌株與優(yōu)質(zhì)氨基酸有機(jī)肥二次固體發(fā)酵制成的新型生物有機(jī)肥，集成了拮抗菌和有機(jī)肥的優(yōu)點(diǎn)，不僅抑制病原菌生長(zhǎng)，減少枯萎病的發(fā)生，同時(shí)提供充足的養(yǎng)分，促進(jìn)作物生長(zhǎng)。產(chǎn)品幾乎對(duì)環(huán)境沒(méi)有副作用，基本符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。試驗(yàn)中所用有機(jī)肥不僅提供充足養(yǎng)分供植物生長(zhǎng)需要，而且提供足夠養(yǎng)分供拮抗菌生長(zhǎng)，從而提高拮抗菌的競(jìng)爭(zhēng)能力。吳洪生等[26]研究表明芽孢桿菌和有機(jī)肥復(fù)合后制成的生物有機(jī)肥能抑制西瓜枯萎??；張慧等[27]研究指出，施用拮抗棉花黃萎病的生物有機(jī)肥使棉花黃萎病的病情指數(shù)顯著降低；Saravanan T等[28]報(bào)道在土壤中使用熒光假單胞桿菌和蘋(píng)果渣混合物能很好地抑制香蕉枯萎病；張樹(shù)生等[29]用枯草芽孢桿菌SQR5和多粘芽孢桿菌SQR21混合強(qiáng)化的有機(jī)肥料能有效防治黃瓜枯萎病。這與本研究得出的各種生物有機(jī)肥與傳統(tǒng)的有機(jī)肥相比，對(duì)土傳黃瓜枯萎病的防治效果更為明顯(圖1)的結(jié)果相一致。因此，利用多株拮抗菌復(fù)合有機(jī)肥制成的生物有機(jī)肥能夠有效提高生防菌株的防治效果，并且這將成為生物防治土傳病害的重要趨勢(shì)之一，然而不同生防菌之間是如何協(xié)同作用的，還有待進(jìn)一步的研究。

引入植物根部的生防菌最終能否發(fā)揮防病促生的效果，很大程度上取決于該菌在不斷伸展的植物根圍的定殖能力，定殖能力強(qiáng)弱決定著生防的成功與失敗[30]。本研究中也通過(guò)熒光顯微鏡和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)生防菌SQR9和T37能在黃瓜根系表面大量的定殖。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)SQR9還能在根表形成生物膜，這與前人報(bào)道的多粘芽孢桿菌在植物根際定殖方式相似[31]。本研究中還采用了營(yíng)養(yǎng)缽育苗施用BIO的方式，我們認(rèn)為這種施用方式更適合生防制劑的生態(tài)行為[7]，它能較好地發(fā)揮根際施肥的優(yōu)勢(shì)，使有益拮抗微生物在黃瓜苗期就定殖于植株根際。施用的BIO中含有足量的有機(jī)物質(zhì)供給功能微生物以足夠的能源物質(zhì)，使這些功能微生物易于在土壤中定殖，形成優(yōu)勢(shì)群落[32]。功能微生物一旦成為優(yōu)勢(shì)群落，就能分泌足夠量的具有特定生物活性的次生代謝物質(zhì)(植物激素、 抗生素等)，在植物根系表面形成有效的“生物防御層”[31]，抑制病原菌的生長(zhǎng)，保護(hù)黃瓜根系免受病原菌的侵入，從而降低了黃瓜枯萎病的發(fā)病率。

由于能在黃瓜植株根表形成“生物防御層”，移入盆缽?fù)寥篮簏S瓜根系定能有效抵御尖孢鐮刀菌病原菌的侵入，并能顯著降低根表尖孢鐮刀菌的數(shù)量。我們通過(guò)real-time PCR方法對(duì)黃瓜根際病原菌計(jì)數(shù)(表1)后發(fā)現(xiàn)： 在黃瓜根際，BIOⅠ處理、 BIOⅡ處理和BIOⅢ處理的FOC數(shù)量顯著低于CK處理，說(shuō)明BIO提供的拮抗菌能夠占領(lǐng)病原菌的生態(tài)位，抑制了FOC的生長(zhǎng)[31]。經(jīng)過(guò)BIOⅢ處理后，F(xiàn)OC數(shù)量可以下降到103水平。BIOⅡ處理和BIOⅢ處理的病原菌數(shù)量沒(méi)有顯著的差異，病原菌數(shù)量都低于BIOⅠ，這種結(jié)果可能是由于哈茨木霉T37有更好的定殖能力。對(duì)比發(fā)病率和病原菌數(shù)量的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)病率高的處理根際病原菌的數(shù)量也高，反之亦然。發(fā)病率的高低取決于根際土壤的尖孢鐮刀菌數(shù)量[33]。

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