瓊膠寡糖緩解嘔吐毒素誘導小鼠肝臟損傷的作用效果與機制

全浩瑋 王慶鳳 王毓甜 李澤昆 米金秋 李天天 馬秋剛 黃世猛*

(1.中國農業(yè)大學動物科學技術學院,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室,北京 100193;2.國家糧食和物資儲備局科學研究院,北京 100037)

霉菌毒素污染是畜禽養(yǎng)殖面臨的主要風險之一,不僅會造成飼料資源浪費,而且當飼糧中霉菌毒素含量超標時,容易造成畜禽肝臟、腎臟以及免疫器官的損傷,從而影響畜禽生產性能和產品品質[1-3]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又稱嘔吐毒素,是污染農作物和畜禽飼料最嚴重的真菌毒素之一,主要由黃色鐮刀菌和禾谷鐮刀菌代謝產生[4]。2021年我國飼糧和飼料原料中霉菌毒素污染狀況調查顯示,調查的1 025份樣品中DON檢出率均達到88%以上,除雜粕未見超標外,其他樣品均有超標[5]。畜禽采食DON污染的飼糧后,會出現采食量下降、營養(yǎng)不良、增重降低、嘔吐腹瀉等癥狀,從而導致生產性能下降和代謝紊亂,給畜牧業(yè)帶來巨大的經濟損失。同時,動物產品中殘留的DON可能通過食物鏈對人類健康構成威脅[6-7]。

畜禽采食DON污染的飼糧后,不僅會造成腸道損傷,還會引起肝臟等臟器毒性。肝臟是機體重要的解毒器官,也是DON在畜禽機體內最重要的靶器官,因此,DON造成的肝臟損傷機制是當前研究熱點之一[8]。研究表明,低濃度和高濃度的DON均可引起肝臟不同程度的組織損傷和細胞損傷,例如肝臟纖維化和細胞毒性,其潛在機制可能與DON抑制DNA、RNA和蛋白質合成,促進核糖體應激、氧化應激和內質網應激,破壞線粒體和細胞膜,最后通過不同途徑誘導細胞死亡有關[9-11]。DON在肝臟組織中降解成DON-葡糖苷酸,并且通過改變不同細胞系中腫瘤抑制蛋白53(p53)、半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱天冬蛋白酶-7(Caspase-7)、半胱天冬蛋白酶-8(Caspase-8)、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)的表達,誘導肝臟損傷[12-13]。同時,DON可誘導糖原減少,增加鐵血黃素顆粒,使光滑內質網和干細胞內核糖體丟失,高濃度的DON可導致肝小葉-門靜脈局部壞死和肝臟損傷[14-16]。當前,DON污染和防治問題引起了人們的強烈關注。因此,尋找有效緩解DON誘導肝臟損傷的技術方案對畜禽生產至關重要。

瓊膠寡糖(agaro-oligosaccharide,AO)作為來源于紅藻的一種低分子質量糖,聚合度為2～20,是經由海藻多糖降解后保留的功能活性成分,易于被機體吸收,生物利用度高,是一種具有益生活性以及抗氧化、抗炎和保肝作用的新型海洋功能性低聚合度寡糖分子[17-21]。研究發(fā)現,瓊膠寡糖可提高脂多糖(LPS)刺激后RAW264.7的細胞活力,劑量依賴性地抑制LPS誘導細胞上清中一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和活性氧(ROS)的生產,減輕炎癥反應,從而預防細胞炎癥的發(fā)生[17]。瓊膠寡糖能否緩解DON誘導的肝臟損傷目前尚未報道。因此,本試驗以DON誘導的小鼠肝臟損傷為研究對象,探究瓊膠寡糖緩解DON誘導小鼠肝臟損傷的作用效果與機制,為瓊膠寡糖作為飼料添加劑的開發(fā)應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用7周齡、初始體重為(20.04±0.80) g的無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級C57BL/6J雌性小鼠32只,適應期為1周,小鼠飼養(yǎng)在中國農業(yè)大學SPF標準環(huán)境中,所有動物試驗均按照中國農業(yè)大學試驗動物福利與動物試驗倫理委員會批準的規(guī)程進行。32只小鼠根據體重隨機分為4組,每組8個重復,每個重復1只。試驗共28 d,分為毒素處理前和毒素處理2個階段。毒素處理前階段,對照組(CON組)和嘔吐毒素組(DON組)小鼠每天灌胃200 μL(200 mg/kg BW)無菌生理鹽水,瓊膠寡糖組(AO組)和瓊膠寡糖+嘔吐毒素組(AO+DON組)小鼠每天灌胃200 μL瓊膠寡糖,連續(xù)處理21 d。毒素處理階段,DON組和AO+DON組小鼠每天灌胃100 μL(4.8 mg/kg BW)DON,CON組和AO組小鼠每天灌胃100 μL無菌生理鹽水,連續(xù)處理7 d。

飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～22 ℃,相對濕度為35%～44%,晝夜光照交替時間為12 h/12 h,自由采食和飲水,每周記錄小鼠的采食量和體重?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content豆粕 Soybean meal16.00豆油 Soybean oil2.30魚粉 Fish meal3.00石粉 Limestone1.50磷酸氫鈣 CaHPO44.00復合維生素預混料 Multi-vitamin premix1)1.00復合礦物質預混料 Multi-mineral premix1)1.00L-半胱氨酸 L-Cys (98%)0.18膽堿 Choline0.05合計 Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.91粗蛋白質 CP18.80粗脂肪 EE5.26粗纖維 CF3.06鈣 Ca1.12總磷 TP0.72賴氨酸 Lys1.40蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys1.15

1.2 樣品采集

在試驗結束時,采用眼球采血,收集小鼠血液樣品。小鼠斷頸、脫臼處死,剖開腹部,收集肝臟組織,稱重并記錄數據;無機械損傷收集肝臟組織,一部分用滅菌生理鹽水沖洗干凈后,置于4%多聚甲醛固定液保存,用于制備切片分析肝臟組織病理學;另一部分液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 指標測定

1.3.1 體重

以組為單位每周對小鼠稱重,記錄數據,計算8、9、10、11、12周齡的體重。

1.3.2 肝臟指數

每只小鼠稱重后,完整取下肝臟組織,用滅菌生理鹽水沖洗干凈,然后用濾紙將血水擦拭干凈后稱重,計算肝臟指數:

肝臟指數(%)=[肝臟重量(g)/體重(g)]×100。

1.3.3 血清細胞因子含量

將采集的血液置于無抗凝劑的離心管,在4 ℃、3 000 r/min離心15 min后收集血清,采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法測定血清白細胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α含量,試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,試驗步驟參照試劑盒說明書。

1.3.4 肝臟細胞因子含量和抗氧化指標

取肝臟組織樣品,置于冰上解凍,經勻漿、離心后,取上清液,測定肝臟IL-1β、白細胞介素-6(IL-6)和TNF-α含量;同時測定肝臟丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)及過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,試驗步驟參照試劑盒說明書。

1.3.5 肝臟組織形態(tài)

每組隨機選取3個重復,小心剪取各組小鼠約1 cm3的肝臟組織,用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,用4%多聚甲醛固定液保存。經脫水、包埋、切片制作5 μm的肝臟組織切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后,在光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學結構。

肝臟組織免疫熒光(IF)試驗操作均在武漢賽維爾生物科技有限公司進行,具體的試驗步驟如下:將石蠟切片進行脫蠟、脫水、抗原修復處理。按照試劑盒的操作說明滴加3%過氧化氫室溫孵育抑制內源性過氧化物酶的活性;用PBS洗滌后加試劑A(封閉液)室溫封閉30 min,甩掉試劑A,滴加一抗F4/80(1∶500)4 ℃過夜,用PBS代替一抗作陰性對照。PBS洗滌后滴加二抗37 ℃孵育30 min,玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5 min。加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液,避光室溫孵育10 min。玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上洗滌3次,每次5 min。加自發(fā)熒光淬滅劑B液5 min,流水沖洗10 min。抗熒光淬滅封片劑封片,然后鏡檢照相,采集圖像。

1.3.6 肝臟生化指標

使用全自動血液生化分析系統(tǒng)(AU5400,Beckman Coulter,美國)測定肝臟谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性及總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量,采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定。

1.3.7 肝臟炎癥損傷相關基因表達

采用RNA提取試劑盒抽提小鼠肝臟組織總RNA,根據說明書要求進行操作,采用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄成cDNA,得到的cDNA用于實時熒光定量PCR檢測肝臟炎癥損傷相關基因表達,引物序列見表2。反應體系為:0.25 μL上游引物,0.25 μL下游引物,6.5 μL無核酸水,3 μL cDNA和10 μL SYBR Green Master Mix,混合成20 μL的反應體系。使用熒光定量PCR儀通過其特異性引物擴增目的基因[TNF-α、IL-1β、IL-6、白細胞介素-8(IL-8)、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)、核因子E2相關因子2(Nrf2)、半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-3和微管相關蛋白1輕鏈3β(LC3B)]mRNA。反應程序為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,35個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參基因,采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達水平。

表2 引物序列

1.4 數據處理與分析

所有試驗數據采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏多重比較檢驗分析組間差異顯著性。結果用平均值±標準誤表示,P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 9.0軟件制作數據圖。

2 結果與分析

2.1 瓊膠寡糖對DON誘導小鼠體重和肝臟指數的影響

如表3所示,4組小鼠8、9、10、11、12周齡的體重均無顯著差異(P>0.05)。DON組和AO+DON組小鼠肝臟指數顯著高于CON組和AO組(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組小鼠肝臟指數有所降低,但差異不顯著(P>0.05)。

表3 瓊膠寡糖對DON誘導小鼠體重和肝臟指數的影響

2.2 瓊膠寡糖對DON誘導小鼠血清和肝臟細胞因子含量及肝臟抗氧化指標的影響

如圖1所示,在血清中(圖1-A和圖1-B),與CON組相比,DON組IL-1β和TNF-α含量顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組IL-1β和TNF-α含量顯著減少(P<0.05)。在肝臟中(圖1-C～圖1-J),與CON組相比,DON組IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量顯著增加(P<0.05),T-AOC及CAT、T-SOD和GSH-Px活性顯著減少(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量顯著減少(P<0.05),T-AOC及CAT、T-SOD和GSH-Px活性顯著增加(P<0.005)。

以上結果表明,DON誘導會增加小鼠血清和肝臟中促炎細胞因子的含量,而添加AO通過降低小鼠血清和肝臟組織中促炎細胞因子含量,增加抗炎細胞因子含量緩解DON誘導的小鼠炎癥損傷。

CON:對照組;AO:瓊膠寡糖組;DON:嘔吐毒素組;AO+DON:瓊膠寡糖+嘔吐毒素組。數據柱標相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 瓊膠寡糖對DON誘導小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

如圖2所示(如箭頭所示),CON組和AO組小鼠肝臟組織病理學切片中肝細胞形態(tài)正常,排列規(guī)則,細胞核位于肝細胞中央,大靜脈附近無明顯炎性浸潤。DON組肝臟細胞出現明顯的細胞瘤樣病變,大靜脈附近出現明顯的炎性浸潤,肝細胞排列呈現不規(guī)則結節(jié)狀,有特征性放射纖維狀。與DON組相比,AO+DON組肝臟組織呈現明顯改善。F4/80免疫熒光染色結果表明,與CON組相比,DON組肝臟巨噬細胞浸潤顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組肝臟巨噬細胞浸潤顯著降低(P<0.05)。

以上結果表明,瓊膠寡糖可緩解DON誘導的小鼠肝臟損傷。

DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 4’,6-diamidino-2-phenylindole;H&E:蘇木精-伊紅 hematoxylin eosin。

2.4 瓊膠寡糖對DON誘導小鼠肝臟生化指標的影響

如圖3所示,與CON組相比,AO組肝臟AST、ALT活性和TG、TC含量顯著降低(P<0.05),而DON組肝臟AST、ALT活性和TG、TC含量顯著增加(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組肝臟AST、ALT活性和TC含量顯著降低(P<0.05)。

圖3 瓊膠寡糖對DON誘導小鼠肝臟生化指標的影響

以上結果表明,DON可導致小鼠肝臟組織功能紊亂,AO可通過調節(jié)AST、ALT活性和TG、TC含量改善肝臟組織功能,緩解DON誘導的小鼠肝臟功能損傷。

2.5 瓊膠寡糖對DON誘導小鼠肝臟炎癥損傷相關基因表達的影響

如圖4所示,與CON組相比,DON組的肝臟IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-3、LC3B的mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2的mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05);與DON組相比,AO+DON組的肝臟IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-3、LC3B的mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)。

以上結果表明,AO對DON誘導的小鼠肝臟炎癥和氧化損傷具有改善作用。

3 討 論

DON作為全球范圍內普遍存在的一種霉菌毒素,全世界每年70%的農作物產品受到霉菌毒素的污染,不僅造成了巨大的經濟損失,也危害動物和人類的健康,例如攝入DON污染的食物會導致急性毒性、胃腸道毒性、肝臟毒性、神經毒性等[5-6]。近些年研究表明,肝臟是DON的主要靶器官,是體內DON解毒和代謝的主要器官,DON在體內和體外均可引發(fā)急性或慢性肝臟損傷(肝臟毒性)[22]。大量研究表明,較高濃度的DON可導致機體肝臟損傷,例如肝臟重量減少、門靜脈和門靜脈周纖維化、腫瘤病變和干細胞細胞質的改變[23],低濃度的DON會導致肝臟組織中度病變。肝臟作為機體重要的代謝器官,廣泛參與許多生物過程,包括新陳代謝、免疫反應、蛋白質合成、解毒和抗菌防御等[24]。因此,本研究致力于明晰DON對小鼠肝臟功能的影響,尋找和篩選能有效緩解DON誘導肝臟損傷的益生元。瓊膠寡糖作為海洋紅藻植物細胞壁中的多糖成分,其分子質量小、水溶性好且易被人體吸收,生物活性和應用價值得到顯著提高,瓊膠寡糖的生物學功能受到人們越來越多的關注,但瓊膠寡糖與緩解肝臟損傷相關聯的報道卻很少,本研究探討了瓊膠寡糖緩解DON誘導小鼠肝臟損傷的效果和作用機制。

臟器指數是重要的生物學特性指標,是指受試動物實質器官重量與體重的比值,在一定程度上反映動物機體內各器官發(fā)育程度。在一般情況下,臟器重量與機體重量呈正相關,但是臟器重量受到多種因素的影響,如自身因素的影響和環(huán)境因素的影響[25],動物機體受到損傷后,其體內臟器重量會發(fā)生變化,臟器指數變大,可能表明該臟器發(fā)生充血、水腫、增生、肥大等病變;臟器指數變小,可能表明該臟器已經萎縮或發(fā)生其他損傷現象。小鼠肝臟指數是反映其肝臟功能是否正常的指標之一[26]。在本研究中,DON導致小鼠的肝臟指數顯著增加,表明肝臟在DON作用下發(fā)生充血、增生和肥大等病變,相比DON組,AO+DON組的小鼠肝臟指數無顯著差異,但有降低的趨勢。同時,與DON組相比,添加瓊膠寡糖可明顯改善DON引起的肝臟組織病理性損傷。F4/80免疫熒光染色結果表明,添加瓊膠寡糖可顯著改善肝臟組織巨噬細胞浸潤,提示了瓊膠寡糖可緩解DON誘導的肝臟損傷。Hong等[27]研究了新瓊寡糖對小鼠高脂飼糧所致肥胖和血糖的影響,結果表明飼喂新瓊寡糖可顯著降低體重,緩解肝臟組織脂肪堆積和囊泡性脂肪變性;同時,新瓊寡糖可顯著降低血清TC、TG、游離脂肪酸含量,可以通過誘導脂聯素的產生來有效抑制肥胖和與肥胖有關的代謝綜合征[28]。由此可見,新瓊寡糖可調節(jié)肝臟組織功能,發(fā)揮抗肥胖和抗糖尿病作用。

抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px被認為是防止氧化損傷的主要防御系統(tǒng),前人研究表明,瓊膠寡糖能提高SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量和AST、ALT活性;瓊膠寡糖添加劑量在400 mg/kg時,肝臟中MDA含量降低了44%,肝臟和血清中SOD和GSH-Px活性升高,血清中ALT活性下降了22.16%[29]。由此可見,瓊脂寡糖不僅通過自身的自由基清除活性發(fā)揮抗氧化作用,而且通過增強宿主抗氧化酶系統(tǒng)來清除ROS,從而緩解氧化損傷,保護肝臟。機體內的抗氧化酶主要包括CAT、SOD、T-AOC和GSH-Px,可從不同角度協助機體清除體內的ROS,在抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用,其含量與機體抗氧化能力呈正相關,通常以上述抗氧化酶活性來評價機體抗氧化能力。與前人研究結果較為一致,本試驗結果提示了DON可導致小鼠肝臟組織中抗氧化酶活性降低和氧化損傷標志物MDA含量增加,而添加瓊膠寡糖可增加抗氧化酶(CAT、T-SOD、T-AOC和GSH-Px)活性。林福娣[30]研究發(fā)現,新瓊寡糖可緩解過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激,增加HepG2肝臟細胞系GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶活性,抑制細胞ROS的產生,從而提升細胞活性。本試驗中,DON顯著增加了小鼠血清AST、ALT活性和TG、TC含量,而添加瓊膠寡糖后,可顯著降低血清AST、ALT活性和TC含量。ALT與AST主要分布在肝細胞內,如果肝臟受損,肝細胞中的轉氨酶便進入血液,血清AST、ALT活性便會升高,ALT和AST活性升高程度與肝細胞受損程度相一致。因此,DON可導致小鼠肝細胞損傷,而添加瓊膠寡糖可以在一定程度上緩解DON對小鼠肝臟的氧化損傷。

同時,在本研究中,DON顯著增加了小鼠血清中促炎細胞因子IL-1β、TNF-α含量,也顯著增加了肝臟中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量,添加瓊膠寡糖后可顯著降低血清和肝臟中促炎細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)含量,緩解DON誘導的小鼠炎癥反應。通過對肝臟mRNA相對表達水平的檢測,DON可顯著增加肝臟IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA相對表達水平量,而添加瓊膠寡糖后可顯著降低肝臟IL-1β、TNF-α和NLRP3的mRNA相對表達水平。通過分析前人研究,例如鄭雅君等[17]研究發(fā)現,瓊膠寡糖對LPS誘導細胞炎癥反應過程中NO的產生具有明顯的抑制作用,且呈劑量依賴,對NO的作用主要源于自身抗炎活性作用,可以顯著抑制LPS刺激巨噬細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的產生和釋放。瓊膠寡糖抑制細胞炎癥主要通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路。Lu等[31]發(fā)現瓊膠寡糖預處理后,添加LPS誘導細胞的MAPK家族激酶c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶 (extracellular signals regulate protein kinases,ERK)、p38的磷酸化水平顯著降低,瓊膠寡糖通過阻斷該信號通路的傳導,進而降低細胞的炎癥介質和細胞因子分泌,減輕細胞炎癥損傷。與大多數研究一致,多糖或寡糖對LPS誘導巨噬細胞的抗炎作用與MAPK信號通路傳導的阻斷密切相關。Lu等[31]研究發(fā)現,茯苓多糖通過MAPK信號通路抑制LPS誘導RAW264.7細胞炎癥,阻斷其中促炎介質ERK和JNK信號通路,抑制促炎因子的基因表達和分泌。Ma等[32]研究發(fā)現,殼聚糖抑制了LPS誘導巨噬細胞中p38、ERK和JNK磷酸化,降低巨噬細胞中促炎細胞因子IL-6和TNF-α的產生。在本研究中,通過分析肝臟中NLRP3、Caspase-3和LC3B的mRNA相對表達水平發(fā)現,與DON組相比,添加瓊膠寡糖可顯著降低上述基因的mRNA相對表達水平,這在一定程度上解釋了瓊膠寡糖可緩解DON誘導的小鼠肝臟損傷。針對瓊膠寡糖通過何種途徑抑制DON誘導肝臟炎癥反應,緩解肝臟損傷,還需后續(xù)試驗的深入探索。

4 結 論

瓊膠寡糖可改善小鼠機體代謝功能,提高小鼠肝臟功能,緩解DON誘導的小鼠肝臟組織的病理損傷、代謝功能損傷、炎癥和氧化損傷,增強機體抗病能力。