C/EBP β與阿爾茨海默病

穆衛(wèi)衛(wèi) 程曉瑩 張艷 代亞美

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種進行性發(fā)展的致死性神經退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力逐步減退，伴有各種神經精神癥狀和行為障礙。其特征性病理改變?yōu)椋杭毎獯嬖谝驭?淀粉樣蛋白(β amyloid，Aβ)沉積為核心的老年斑，細胞內有高度磷酸化tau蛋白聚集形成的神經原纖維纏結，并伴有血管淀粉樣變性及神經元的丟失。AD也是一個局灶性的、非免疫介導的神經系統(tǒng)炎性反應過程，在腦內可見到大量激活的小膠質細胞、反應性星形膠質細胞、補體成分和炎性細胞因子等?；罨男∧z質細胞和星形膠質細胞分布于Aβ沉積的部位，并且相應地導致一系列細胞因子、趨化因子和氧自由基的產生增加。在腦內顳葉和邊緣系統(tǒng)等AD病理改變最典型的部位，神經系統(tǒng)炎性反應也最為明顯[1]。AD患者大腦中存在著明顯非特異性免疫炎性反應，主要表現(xiàn)為白細胞介素-1(IL-1)、IL-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細胞因子在AD腦組織內水平升高[2]。與同齡野生型小鼠相比，在雙重轉基因APP/PS1小鼠腦內，可檢測到某些炎性細胞因子(如IL-1α，IL-1β，TNF-α和IL-6等)水平顯著性增加，并與腦內可溶性和不可溶性Aβ水平直接相關，提示Aβ的病理性沉積是腦內炎性反應的關鍵性促發(fā)因素[3]。因此Aβ聚集和沉積激活神經膠質細胞，并引起慢性神經炎性反應是AD的核心病理機制之一。研究已經發(fā)現(xiàn)幾種轉錄因子參與膠質細胞的活化，包括核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和CCAAT 增強子結合蛋白(CCAAT enhancer binding protein，C/EBP)等，C/EBP家族成員能放大NF-κB的功能，并與其形成異聚復合物[4]。

1 C/EBP β的分子結構和功能

C/EBP家族是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族。C/EBP 家族成員包括C/EBP α、C/EBP β、C/EBP γ、C/EBP δ、C/EBP ε和C/EBP ζ等蛋白。C/EBP 家族成員的共同特征是其蛋白質分子包括3個相似的結構組分：C末端的亮氨酸拉鏈區(qū)，N末端的轉錄激活域，中間的DNA結合域[5]。在C/EBP β的轉錄激活域和DNA結合域之間有兩個負調控域(RD1和RD2)。RD1位于臨近N末端轉錄激活域的部分，主要調控轉錄激活活性；RD2位于堿性亮氨酸拉鏈的上游，與 C/EBP β活性的細胞特異性有關[6]。C/EBP β的mRNA通過選擇性剪切可生成4種異型體蛋白：相對分子質量為38 000的C/EBP β(LAP*)、35 000的 LAP(liver-enriched transcriptional activator protein)、21 000的LIP(liver-enriched transcriptional inhibitory protein)和一個相對分子質量為14 000的蛋白，其中LAP和LIP是主要的剪切體，而LAP*很少。LAP 包含激活域和堿性亮氨酸拉鏈域，具有全部的活性。而 LIP 僅有堿性亮氨酸拉鏈域，但是可以和其他家族成員形成無活性的異源二聚體，起到一種負調控作用(圖1)。C/EBP β在細胞內形成多種同源和異源二聚體，從而明顯增加了其靶基因的多樣性[6]。

C/EBP有多種生物學功能，涉及到能量代謝、肝臟再生、細胞周期、炎性反應和多種疾病的病理。

transcriptional activating domain：轉錄激活域；DNA binding domain：DNA結合域；Leucine Zipper COOH：C段亮氨酸拉鏈域

圖1C/EBP β mRNA轉錄起始位點圖譜[6]

在原代混合培養(yǎng)的星形膠質細胞-小膠質細胞，C/EBP α、β和δ均有表達。C/EBP α、β和δ在腦內也有表達，其靶基因包括有許多炎性細胞因子，如IL-6(AD腦內早期炎性反應標志物)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和補體分子等[7]。在腦內和肝臟，炎性反應刺激通常導致C/EBP α表達下調，C/EBP β和δ表達上調。

C/EBP β在一系列巨噬細胞和膠質細胞特異性基因的協(xié)同表達和細胞表型分化方面，具有極為重要的作用，是參與巨噬細胞和膠質細胞活化的關鍵性轉錄因子[8]。C/EBP β在炎性反應過程中的活化，可以發(fā)生在轉錄和翻譯后水平。在體實驗發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6、血清剝奪和內毒素可增加C/EBP β mRNA的水平[9]。C/EBP β磷酸化可以通過直接增加DNA結合活性和誘導核位移調節(jié)C/EBP β的活化[10]。

2 C/EBP β在AD發(fā)病機制中的作用

有研究表明，在AD發(fā)病過程中，在Aβ的作用下C/EBP轉錄因子家族成員出現(xiàn)表達和功能異常。AD患者腦內海馬C/EBP α、β和δ mRNA水平上調，且AD腦內C/EBP δ蛋白質水平也增加[11]。

2.1C/EBPβ與Aβ在攜帶有Arctic和Swedish突變的Tg-ArcSwe轉基因鼠腦內有大量的纖絲狀Aβ沉積，在老齡鼠(16月齡)的前腦C/EBP β水平顯著增加。由于在小鼠腦組織內C/EBP可以出現(xiàn)于神經元和神經膠質細胞中，因此無法確切識別Tg-ArcSwe轉基因鼠腦內的C/EBP表達變化是發(fā)生在哪一種細胞類型中。推測C/EBP不同亞型的表達水平差異，反映出Aβ沉積對于不同細胞類型的影響，諸如在受累和未受累的腦區(qū)C/EBP α水平均下降；在受累腦區(qū)C/EBP β水平升高；僅在受累腦區(qū)C/EBP δ水平下降[12]。然而離體實驗研究的結果卻與在體實驗完全不同， Samuelsson等研究發(fā)現(xiàn)，在混合培養(yǎng)的大鼠原代神經膠質細胞中，Aβ1-42和Aβ25-35能夠阻斷炎性細胞因子IL-1β或脂多糖(LPS)誘導的C/EBP活化[13]。此研究似乎與AD模型鼠腦內C/EBP蛋白質水平升高的結論相矛盾，但該研究是一個急性實驗，與AD模型鼠腦組織長期暴露于Aβ沉積的刺激有所不同。據此推斷，由于Aβ肽段引起NF-κB和C/EBP兩種轉錄因子之間平衡失調，導致神經膠質細胞對炎性刺激出現(xiàn)異常反應。

除參與神經炎性反應過程外，C/EBP家族成員是長程記憶鞏固期的必要成分。在記憶形成過程中，環(huán)腺苷酸應答元件結合蛋白(cAMP-response element-binding protein, CREB)的活化誘導C/EBP β和δ產生。補體成分C5的衍生物C5a在腦內具有保護神經元免受谷氨酸誘導的凋亡和Aβ毒性的作用。在C5a受體缺失小鼠出現(xiàn)嚴重的認知功能損害，并伴有CREB/C/EBP β通路表達下調。因此C5a能通過上調CREB/C/EBP β信號轉導通路，保護突觸的可塑性，改善認知功能[14]。

已有研究表明，老年人受到腦外傷后導致的腦內炎性反應比青年人嚴重。利用C57/BL6小鼠研究發(fā)現(xiàn)，在實驗性腦外傷后的第1天，C/EBP β表達上調，而且在成年鼠和老年鼠之間C/EBP β mRNA水平無統(tǒng)計學差異；但在老年鼠腦內C/EBP β蛋白質水平升高。推斷在老年腦外傷患者腦內C/EBP β表達的異常增加可能與劇烈的炎性反應以及不良預后相關[15]。

2.2C/EBPβ與神經膠質細胞活化很多炎性基因的啟動子區(qū)可能包含有C/EBP β的共有序列。研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經系統(tǒng)星形膠質細胞和小膠質細胞受到各種炎性刺激(諸如IL-1β、LPS、TNF-α和HIV-1等)后其細胞內C/EBP β表達會增加[16]。C/EBP β參與調節(jié)IL-6、一氧化氮合酶-2、補體蛋白3以及其他眾多重要基因的表達。C/EBP β異形體蛋白的特異性活性與組織微環(huán)境和細胞類型相關。在缺血或受到興奮性損傷條件下，C/EBP β的缺乏起到神經保護作用[17]。

2.2.1C/EBP β與星形膠質細胞活化：星形膠質細胞在保持中樞神經系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)、調節(jié)神經信號傳導和保護血-腦脊液屏障的完整性方面具有重要作用。星形膠質細胞參與神經炎性反應過程，在炎性刺激作用下，其基因表達、形態(tài)和功能均發(fā)生改變。在AD腦內，Aβ斑塊周圍的反應性星形膠質細胞在炎性細胞因子的作用下產生急性期反應蛋白，如C/EBP β和δ轉錄因子。利用小鼠原代培養(yǎng)的星形膠質細胞研究發(fā)現(xiàn)，LPS、IL-1β和TNF-α能誘導其C/EBP β和δ基因表達增加。因此C/EBP β和δ除參與腦內的糖代謝調節(jié)外，還是腦內炎性反應的關鍵性轉錄因子[7]。

在HIV-1相關認知障礙〔human immunodeficiency virus (HIV)-1-associated neurocognitive disorders，HAND〕，HIV-1和炎性細胞因子可導致人腦內星形膠質細胞的基因表達出現(xiàn)異常改變，C/EBP β mRNA和其蛋白質異形體在腦內表達增加，并刺激星形膠質細胞分泌金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor metalloproteinases，TIMP-1)[18]。TIMP-1主要由星形膠質細胞產生，它是一種多功能糖蛋白，可調節(jié)細胞外基質的合成和細胞生長/凋亡。在IL-1β活化的人星形膠質細胞，過度表達的C/EBPβ能增加TIMP-1啟動子的活性，增加mRNA和蛋白質水平。應用小RNA干擾敲除C/EBP β，能降低TIMP-1 mRNA和蛋白質水平[19]。

研究表明免疫活化的星形膠質細胞參與多種中樞神經系統(tǒng)疾病的病理過程，然而調控基因表達的炎性反應信號通路并不清楚。將IL-1β作用于原代培養(yǎng)的人星形膠質細胞12 h可導致92個炎性基因中的29個表達增加至少2倍；當敲除C/EBP β后，29個基因中的17個表達受到影響，其中兩個神經炎性反應相關基因COX-2和緩激肽受體B2(bradykinin receptor B2，BDKRB2)的表達分別相應地顯著減低和升高[20]。在IL-1β介導的神經炎性反應過程中，星形膠質細胞的基因調節(jié)過程非常復雜，其中對C/EBP β、TIMP-1、COX-2和BDKRB2的調節(jié)與細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase， ERK1/2)和p38激酶(p38 kinase，p38K)信號轉導通路相關。利用原代培養(yǎng)的人星形膠質細胞研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通過調節(jié)信號通路下游的C/EBP β表達可增加IL-1β誘導的TIMP水平；p38K的活化可增加IL-1β誘導的細胞內TIMP-1和C/EBP β水平。因此，在星形膠質細胞內，ERK1/2和p38K信號轉導通路可分別作為調控中樞神經系統(tǒng)內TIMP-1和C/EBP β水平的作用靶點。鑒于C/EBP β在AD患者腦內表達增加，因此認識C/EBP β在人星形膠質細胞炎性反應中的作用，有助于進一步尋求治療AD的作用靶點[21]。

2.2.2C/EBP β與小膠質細胞活化：小膠質細胞是組織相關性巨噬細胞，對中樞神經系統(tǒng)具有動態(tài)監(jiān)視功能。絕大多數損傷因子使小膠質細胞呈現(xiàn)M1表型，從而產生炎性細胞因子、活性氧和花生四烯酸等，另外使清道夫受體和化學因子生成增加，細胞吞噬活性增強。M2表型則以IL-4、IL-10、轉移生長因子β和神經營養(yǎng)因子的產生為特征。

在混合培養(yǎng)的小鼠原代星形膠質細胞和小膠質細胞內均有C/EBP β表達。LPS誘導膠質細胞活化后2 h出現(xiàn)C/EBP β mRNA升高，4 h蛋白質表達水平顯著增加；兩種膠質細胞的細胞核內C/EBP β水平增加，在小膠質細胞中表現(xiàn)更為明顯[22]。C/EBP β與炎性基因啟動子區(qū)的結合活性增強。當敲除C/EBP β基因后，可觀察到炎性基因表達水平下降和小膠質細胞的神經毒性作用消失[23]。LPS誘導的小膠質細胞內C/EBP β增加，能夠被p38抑制劑、JUK抑制劑和ERK抑制劑所阻斷。在體實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射LPS導致腦組織內細胞核C/EBP β水平升高，而免疫熒光雙標檢測定位C/EBP β主要表達在小膠質細胞[22]。由此可見，在小膠質細胞活化過程中，C/EBP β是一個關鍵性轉錄因子，能調節(jié)炎性細胞因子的表達，因此C/EBP β可以作為一個治療靶點，減輕炎性刺激導致的神經元損傷。

前列腺素E2在神經炎性反應發(fā)病機制中具有重要的作用。C/EBP β是前列腺素合成酶的一個關鍵性調節(jié)因子，通過影響前列腺素E2的水平，參與調節(jié)腦內神經系統(tǒng)炎性反應過程。在離體狀態(tài)下，C/EBP β能調節(jié)活化的小膠質細胞內前列腺素合成酶的表達和前列腺素E2的生成。通過給敲除C/EBP β基因小鼠腹腔內注射LPS不能誘導腦內前列腺素合成酶的表達顯著增加[24]。

綜上所述，AD是一個局灶性的、非免疫介導的神經系統(tǒng)炎性反應過程，腦內Aβ沉積導致C/EBP β出現(xiàn)表達和功能異常。很多炎性基因的啟動子區(qū)可能包含有C/EBP β的共有序列，因此C/EBP β是參與神經膠質細胞活化的關鍵性轉錄因子。在敲除C/EBP β基因后，可觀察到炎性基因表達水平下降和小膠質細胞的神經毒性作用消失。因此，深入認識C/EBP β在膠質細胞活化中的作用，將為減輕神經元炎性損傷提供一種新的治療方案。

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