重癥肌無力與IL-17、RORγt水平的關(guān)系

金迪 付錦 李穎

既往研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一種CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，該細(xì)胞特異性地產(chǎn)生白細(xì)胞介素17(IL-17)。維甲酸相關(guān)孤兒受體γ(retinoid-related orphan receptors-γt，RORγt)為Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子[1]?，F(xiàn)已證實(shí)，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子，在多種自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化)和炎性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。既往關(guān)于重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)和Th17細(xì)胞關(guān)系的研究，主要是關(guān)于MG動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)和Th17細(xì)胞相關(guān)性的研究，關(guān)于MG與Th17細(xì)胞相關(guān)性的研究還很少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)MG患者外周血中IL-17水平，分析其與MG嚴(yán)重程度相關(guān)性，并檢測(cè)Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)量，探討Th17細(xì)胞在MG中的可能作用及機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1觀察對(duì)象選取作者醫(yī)院住院的MG確診患者80例，男42例、女38例，年齡18～82歲，平均年齡(43.45±19.24)歲?；颊呔鶠榘l(fā)病2周內(nèi)，并根據(jù)MG診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]診斷，包括反復(fù)發(fā)生的骨骼肌耐力下降，疲勞試驗(yàn)(+)，新斯的明試驗(yàn)(+)，肌電圖低頻重復(fù)神經(jīng)電刺激波幅遞減和膽堿酯酶抑制劑有效等進(jìn)行診斷，并排除并發(fā)心腦血管疾病、糖尿病，甲狀腺功能亢進(jìn)、嚴(yán)重肝腎功能不全、腫瘤患者，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病患者，感染性疾病患者，以及入院前3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用炎性抑制劑、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素的患者?；颊呔性鰪?qiáng)胸腺CT檢查明確有無胸腺瘤。根據(jù)Osserman分型將MG患者分為4組：眼肌型組20例，男8例、女12例，年齡18～56歲，平均年齡(32.10±11.99)歲；輕度全身型組24例，男、女各12例，年齡21～72歲，平均年齡(41.04±17.35)歲；中度全身型組20例，男12例、女8例，年齡23～80歲，平均年齡(48.05±20.93)歲；急性重癥型組16例，男10例、女6例，年齡30～82歲，平均年齡(56.13±19.07)歲。

健康對(duì)照(對(duì)照組)30名，男16名、女14名，年齡18～79歲，平均年齡(47.90±18.61)歲，均為作者醫(yī)院體檢中心健康體檢者，既往無自身免疫性疾病和高血壓、糖尿病等慢性疾病，并且采血前1個(gè)月內(nèi)未患感冒、腹瀉等感染性疾病。

1.2方法所有MG患者均于入院次日晨、健康對(duì)照于體檢當(dāng)日晨取空腹時(shí)肘靜脈血，其中4 mL(無抗凝劑)血清用于細(xì)胞因子IL-17的ELISA檢測(cè)，6 mL(以K2EDTA抗凝)用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)。

1.2.1血清IL-17水平檢測(cè)：用ELISA法檢測(cè)血清IL-17(ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照，操作過程按產(chǎn)品說明分別進(jìn)行，蛋白包被、孵育一抗和二抗后加入顯色劑， 30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度〔D(λ)〕值。結(jié)果判讀使用CurveExpert1.3軟件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度D(λ)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的D(λ)值在該曲線上計(jì)算出相應(yīng)的IL-17含量。

1.2.2MG患者病情嚴(yán)重程度評(píng)分：采用重癥肌無力臨床絕對(duì)評(píng)分法[3]評(píng)分，雙側(cè)分別評(píng)分。

1.2.3IL-17水平與MG病情嚴(yán)重程度相關(guān)性：分析IL-17水平與MG肌無力程度評(píng)分的相關(guān)性。

1.2.4各組RORγt mRNA檢測(cè)：(1)血漿總RNA提取：在試管中加入適量體積淋巴細(xì)胞分離液，將抗凝血6 mL與Hank’s液按體積1∶1充分混勻后疊加于分層液面上，以1500 r/min水平離心(離心半徑15 cm)15 min，離心管由上至下分為4層，第1層為血漿，第2層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細(xì)胞層。用直頭吸管插到第2層，吸取收集淋巴細(xì)胞置入另一試管中，加入5倍以上體積的Hank’s液以1500 r/min(離心半徑15 cm)離心10 min，棄上清，加入小牛血清終濃度為10%(體積濃度)的RPMI1640重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，吸取l×106個(gè)細(xì)胞，按照逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(TaKaRa寶生物工程有限公司)說明步驟提取總RNA，于55～60℃下孵育10 min。從提取的總RNA中取部分樣品用紫外分光光度儀分別測(cè)定260 nm和280 nm的D(λ)值，計(jì)算RNA樣品純度R值〔R=D(λ)260 nm/D(λ)280 nm〕，R值在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度較好，雜質(zhì)污染少，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。剩余樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?2)引物設(shè)計(jì)：RORγt上游引物為5′-ACCTCACGAGGCCATTCAG-3′，下游引物為5′-TAGGCC CGGCACATCCTAAC-3′，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度169 bp；參照基因GAPDH上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度210 bp。(3)RT-PCR檢測(cè)：取備用總RNA 1 μg，依據(jù)試劑盒(購(gòu)自Takara公司 RR041A)說明步驟進(jìn)行。反應(yīng)條件：30℃10 min、45℃30 min、99℃5 min、5℃5 min，42℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，95℃變性5 min，70℃10 min終止反應(yīng)，置于冰上，所得cDNA 1 μL用于PCR擴(kuò)增，其余于-20℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，RORγt反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 45 s，48℃ 45 s，72℃ 75 s，共進(jìn)行30個(gè)循；72℃延伸10 min，于4℃終止反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物置-20℃凍存?zhèn)溆谩?4)檢測(cè)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物：擴(kuò)增產(chǎn)物在2%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠中以5 V/cm穩(wěn)壓電泳20 min， Maker相對(duì)分子質(zhì)量為2000，紫外燈下觀察結(jié)果并攝影。采用MGIAS-1000型圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每組標(biāo)本RORγt以及GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的D(λ)值，計(jì)算RORγt與GAPDH的D(λ)比值，作為RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組血清IL-17水平眼肌型組、輕度全身型組、中度全身型組及急性重癥型組患者血清IL-17水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，MG各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=96.12，P<0.05)，輕度全身型組高于眼肌型組，中度全身型組高于輕度全身型組和眼肌型組，急性重癥型組高于輕度全身型組和眼肌型組(均P<0.05)，中度全身型組與急性重癥型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.2血清IL-17表達(dá)水平及其與MG嚴(yán)重程度相關(guān)性分析MG各組患者肌無力程度評(píng)分見表1。MG患者血清IL-17水平與重癥肌無力疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.867，P<0.05)。

2.3各組RORγtmRNA相對(duì)表達(dá)各實(shí)驗(yàn)組RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量見表1和圖1。除眼肌型組外，MG各組RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)；MG各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=109.82，P<0.05)；輕度全身型組高于眼肌型組，中度全身型組高于輕度全身型組和眼肌型組，急性重癥型組高于中度全身型組、輕度全身型組和眼肌型組(均P<0.05)。

1：眼肌型組2：輕度全身型組3：中度全身型組4：急性重癥型組 5：對(duì)照組；M：Maker 2000

圖1各組RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)的RT-PCR電泳圖

表 1 各實(shí)驗(yàn)組肌無力評(píng)分、血清IL-17水平和RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與眼肌型組比較，△P<0.05；與輕度全身型組比較，﹟P<0.05；與中度全身型組比較，▲P<0.05

3 討論

MG發(fā)病機(jī)制涉及遺傳因素、自身抗體作用、細(xì)胞免疫和細(xì)胞因子作用、補(bǔ)體作用以及胸腺異常等多方面因素[4]。MG的細(xì)胞免疫是由Th1細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子主導(dǎo)的，MG發(fā)病過程中Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子主要為干擾素γ(IFN-γ)，IFN-γ能提呈肌肉乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)表位，促進(jìn)B細(xì)胞成熟并輔助產(chǎn)生乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)[5]，進(jìn)一步增強(qiáng)針對(duì)AChR的免疫損傷。Mu等[6]關(guān)于雌性路易鼠EAMG的研究中于EAMG晚期檢測(cè)到脾組織中IFN-γ和IL-17增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例的增加，而且隨著Th17細(xì)胞的數(shù)量增多，高水平IL-17使EAMG加重。此研究提示在MG發(fā)生發(fā)展過程，Th17細(xì)胞可能在高水平IL-17情況下起到了關(guān)鍵的作用。另有一項(xiàng)究發(fā)現(xiàn)，IL-17可以通過與IL-17受體(IL-17R)結(jié)合，活化有絲分裂原活化蛋白激酶(MAP)和核因子(NF-κB)，并在多種細(xì)胞因子、炎性趨化因子、協(xié)同刺激信號(hào)等參與下，由AChR α亞基97-116肽段(R97-116肽)誘導(dǎo)，增強(qiáng)T細(xì)胞的啟動(dòng)活化與增殖，上調(diào)T細(xì)胞應(yīng)答水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，從而參與MG的病理過程[7]。目前研究已知MG的病理過程與EAMG晚期時(shí)非常相似，提示在人類MG病理過程中IL-17可能也存在這種變化。目前關(guān)于MG患者與Th17細(xì)胞關(guān)系的研究極少。本研究結(jié)果顯示MG患者外周血IL-17水平明顯高于對(duì)照組，這與上述關(guān)于EAMG晚期研究的結(jié)果相一致，提示在人類MG病理過程中，IL-17可能通過上調(diào)T細(xì)胞應(yīng)答，參與MG的發(fā)病過程，并在高水平IL-17形成后導(dǎo)致MG發(fā)病。

B細(xì)胞活化因子(BAFF)是有效的B細(xì)胞存活因子，其在維持B細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及成熟方面發(fā)揮了重要作用[8]，并隨著AChR水平增加而增多。Barbosa等[9]的研究表明IL-17可能通過BAFF合作協(xié)調(diào)來增加人類B細(xì)胞存活率及維持其成熟。在本實(shí)驗(yàn)中IL-17水平與MG疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)，也提示L-17可能通過與BAFF協(xié)同參與MG的病理過程。Barbosa等[9]的研究結(jié)果還顯示IL-17可能通過誘導(dǎo)AChR特異性B細(xì)胞的增殖，并在生發(fā)中心導(dǎo)致原始的B細(xì)胞積累，進(jìn)一步促進(jìn)AChR及其抗體的產(chǎn)生。既往研究表明， IL-17誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖這一過程是接合體分子激活劑1(Act1)通過成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子白細(xì)胞介素17-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子白細(xì)胞介素17受體結(jié)構(gòu)域(SEFI-SEFIR)之間的相互作用，募集IL-17受體并激活B細(xì)胞增殖分化的NF-κB和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)這兩條途徑實(shí)現(xiàn)的[10]，而IL-17介導(dǎo)的T細(xì)胞活化也涉及NF-κB途徑，也支持IL-17可能通過介導(dǎo)T細(xì)胞活化及B細(xì)胞增殖參與MG發(fā)生發(fā)展過程。

RORγt是Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子[11]。Ruan等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞的免疫作用是由c-Rel蛋白-維甲酸相關(guān)孤兒受體γ-維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(Rel-RORγ-RORγt)軸控制的?？乖岢始?xì)胞(APCs)在IL-1、IL-6、IL-23和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)存在的條件下，結(jié)合T細(xì)胞抗原受體(TCR)、CD28、IL-1或IL-23受體導(dǎo)致蛋白激酶Iκκβ活化，并磷酸化抑制蛋白IκBα，釋放c-Rel- p65結(jié)合蛋白(c-Rel和p65均為Rel/NF-κB家族成員)二聚體移行至細(xì)胞核，結(jié)合單基因RORγ和RORγt啟動(dòng)子而啟動(dòng)Th17分化，在細(xì)胞因子作用下生成IL-17[13]。本實(shí)驗(yàn)中，MG各組患者RORγt mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組，且MG各組間RORγt mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再一次從轉(zhuǎn)錄水平表明，RORγt作為Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)Th17分化，生成IL-17，在MG的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，本研究還推測(cè)RORγt mRNA可能在間接形成IL-17后參與MG分型及疾病嚴(yán)重程度高低。由于RORγt存在異構(gòu)體RORγ，而RORγ也同樣介導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，因此是否MG發(fā)病過程中主要涉及RORγt或二者兼有，以及二者作用的大小均需要進(jìn)一步明確。

本研究結(jié)果顯示，MG患者外周血IL-17水平和RORγt mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，且外周血IL-17水平與MG嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，推測(cè)RORγt mRNA可能也是人類MG的特異性轉(zhuǎn)錄因子，并推測(cè)高水平IL-17形成后可能導(dǎo)致MG發(fā)病，但是否在人類Th17細(xì)胞中存在其他轉(zhuǎn)錄因子及RORγt 在人類MG中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制、IL-17參與MG發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制等都需進(jìn)一步研究。

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