雌激素對(duì)中華鱉性腺分化及DMRT1、SOX9基因表達(dá)的影響

王 莉胡 濤宓猛冬楊克周錢(qián)國(guó)英葛楚天

(1. 浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院, 寧波 315100; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

雌激素對(duì)中華鱉性腺分化及DMRT1、SOX9基因表達(dá)的影響

王 莉1,2胡 濤1宓猛冬1楊克周1錢(qián)國(guó)英1,2葛楚天1

(1. 浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院, 寧波 315100; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)性別決定的方式一直存在較大的爭(zhēng)議, 分子機(jī)制更是不清楚。在大部分脊椎動(dòng)物中, 雌激素在性別決定和性腺分化中扮演重要的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)性別分化前胚胎進(jìn)行雌二醇(E2)和芳香化酶抑制劑(AI)處理, 研究雌激素在中華鱉性腺分化中的作用及機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與對(duì)照組(雌性比例49%)相比, E2處理組中雌性中華鱉仔鱉比例顯著增加, 高達(dá)92.3%; 而在AI處理組中, 雌性比例顯著下調(diào)至13.1%。HE染色分析表明, ZZ(雄性)和ZW(雌性)胚胎分別經(jīng)過(guò)E2和AI處理后, ZZ和ZW性腺結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的雌性化和雄性化特征。同時(shí), 通過(guò)RT-PCR和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn), E2能顯著降低雄性性別關(guān)鍵因子DMRT1和SOX9 mRNA和蛋白表達(dá)水平; AI則表現(xiàn)相反的調(diào)節(jié)作用。綜上所述, 雌激素通過(guò)抑制雄性性別關(guān)鍵因子DMRT1和SOX9的表達(dá)來(lái)抑制雄性分化, 促進(jìn)雌性分化, 揭示雌激素在中華鱉雌性性別分化中起著重要的調(diào)控作用。

雌激素; DMRT1; SOX9; 性別分化; 性腺發(fā)育; 中華鱉

中華鱉(Pelodiscus sinensis)的性別決定方式一直存在較大爭(zhēng)議[1—4], 現(xiàn)已基本確定中華鱉存在微小性染色體 ZW, 屬于基因型性別決定機(jī)制(Genetic sex determination, GSD)[5], 但目前中華鱉性別決定和性腺分化的分子機(jī)理尚不清楚。性別決定是一個(gè)復(fù)雜的、多基因精確調(diào)控和激素介導(dǎo)的過(guò)程。哺乳動(dòng)物GSD的分子機(jī)理研究表明位于Y染色體的SRY基因是性別決定的主控基因, 上調(diào)SOX9、SF1、MIS、WT1和DAX1等基因的表達(dá), 聯(lián)合性激素的介導(dǎo)作用, 最后決定性器官的分化發(fā)育[6,7]。因此, 要解析中華鱉性腺分化的分子機(jī)理首先是要找出其性別決定的關(guān)鍵基因及其與性激素之間的互作關(guān)系。

在參與性別決定和性腺分化的關(guān)鍵基因中, DMRT1(Double sex-and mab3-related transcription factor1)基因是目前為止已知的唯一在動(dòng)物門(mén)間保守的基因。在脊椎動(dòng)物中, DMRT1與SRY基因相似,在雄性胚胎中專(zhuān)一性表達(dá), 并參與了雄性的性別決定過(guò)程, 該基因的缺失會(huì)導(dǎo)致性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。相關(guān)研究表明在鳥(niǎo)類(lèi)、一些魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)上, DMRT1或其同源基因位于雄性性染色體(Z或Y)上, 是性別決定的主控基因[8—10]。在龜鱉類(lèi)中, DMRT1基因在雄性性腺中呈現(xiàn)特異性表達(dá), 如紅耳龜[11]和太平洋麗龜[12]。SOX9(Sry-type HMG box9)基因是另一個(gè)重要的雄性性腺分化關(guān)鍵基因, 在哺乳動(dòng)物雄性睪丸發(fā)育中與SRY基因共同作用調(diào)控下游基因的表達(dá)[13]。在八孔海龜中, SOX9基因在雄性性腺中的表達(dá)量顯著高于雌性性腺[14]。本實(shí)驗(yàn)室已克隆獲得了中華鱉DMRT1和SOX9基因, 并發(fā)現(xiàn)它們?cè)谥腥A鱉性腺發(fā)育中呈現(xiàn)雄性特異性表達(dá)。

除了關(guān)鍵基因外, 性激素往往在性腺分化過(guò)程中也扮演著重要的調(diào)控角色。在龜鱉類(lèi)性腺分化發(fā)育過(guò)程中, 精巢來(lái)自雙向潛能性腺髓質(zhì)的發(fā)育和皮質(zhì)的退化; 卵巢剛好相反, 來(lái)自雙向潛能性腺皮質(zhì)的發(fā)育和髓質(zhì)的退化[15]。雌激素在該過(guò)程中起重要作用:它對(duì)雙向潛能性腺的皮質(zhì)和髓質(zhì)的發(fā)育分別起促進(jìn)和抑制作用, 從而決定性腺的雌性發(fā)育方向[16,17]。研究發(fā)現(xiàn), 在產(chǎn)雄性溫度下, 向菱斑龜、密河鱷、恒河鱷胚卵注入雌二醇, 可誘導(dǎo)胚胎向雌性方向發(fā)育[18,19]。動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源雌激素是由內(nèi)源雄激素轉(zhuǎn)化而來(lái), 芳香化酶(P450arom)是催化該反應(yīng)的關(guān)鍵酶, 可使雄烯二酮或睪酮氧化脫去19-甲基, 轉(zhuǎn)變成雌酮或雌二醇, 控制著體內(nèi)雌雄性激素的平衡[20]。雌性歐洲龜經(jīng)過(guò)芳香化酶抑制劑處理后, 體內(nèi)雌激素合成受到抑制, 性腺向雄性方向發(fā)育[21]。

本實(shí)驗(yàn)采用雌二醇與芳香化酶抑制劑在特定的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)上對(duì)中華鱉胚胎進(jìn)行處理, 待仔鱉出殼后對(duì)鱉胚性腺結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織學(xué)分析, 同時(shí)從 mRNA和蛋白水平分析DMRT1和SOX9基因的表達(dá)變化,研究雌激素在中華鱉性腺分化中的作用及對(duì)DMRT1和SOX9基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雌二醇(17β-estradiol, E2), 芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司; PCR擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司; 驢血清購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司; 鼠源β-Catenin單克隆抗體、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; DMRT1、SOX9兔源多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司; Alexa Fluor?488 驢抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor?594 驢抗鼠IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 中華鱉卵孵化及性激素處理

中華鱉卵采自浙江紹興中亞鱉養(yǎng)殖場(chǎng), 采用全裸無(wú)接觸式加濕孵化箱進(jìn)行孵化。中華鱉受精卵采集時(shí)間控制在產(chǎn)卵后 12h之內(nèi), 將采集的鱉卵直接裸立于孵化盤(pán)定位孔中, 設(shè)定孵化溫度 31 , ℃ 開(kāi)啟超聲波霧化加濕器, 濕度控制在 75%—85%。孵化1d后, 棄去未受精卵, 調(diào)整動(dòng)物極, 使其朝上發(fā)育。設(shè)置3個(gè)孵化箱, 分別為對(duì)照組、雌激素處理組和芳香化酶抑制劑處理組, 每組為200枚中華鱉受精卵。

孵化至15期時(shí), 在正對(duì)胚胎的卵殼上滴加5 μL藥物。對(duì)照組為 5 μL 95%乙醇, 實(shí)驗(yàn)組分別為50 μg/μL雌二醇(E2)和 50 μg/μL芳香化酶抑制劑(AI)。孵化至第17期進(jìn)行第二次藥物處理(用量與第一次等同)。

1.3 性腺提取及處理

收集出殼的稚鱉, 統(tǒng)計(jì)孵化率和平均體重, 宰殺后在體視顯微鏡下分離并提取性腺-中腎復(fù)合體。剝離一條性腺用于 RNA提取, 另一半性腺-中腎復(fù)合體用于組織學(xué)染色分析; 同時(shí)取每只稚鱉的心臟組織用于染色體核型分析。

1.4 性腺總RNA提取及RT-PCR

將每組中10個(gè)性腺組織, 按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取, 用核酸蛋白分析儀(Nanodrop)測(cè)定總 RNA濃度及純度, 用 RNase-free水稀釋使總RNA 濃度約為 2—5 μg/μL, –80℃冷凍保存。在PrimeScript Reverse Transcriptase (TaKaRa)和1 μL Oligo d(T)18Primers引物作用下合成 cDNA。以此cDNA為模板, 按照以下參數(shù)表 1進(jìn)行 PCR擴(kuò)增: 94 ℃ 預(yù)變性5min; 94℃變性 30s, 退火30s, β-actin引物退火溫度為 59.5 , ℃ DMRT1基因引物退火溫度為57.3 , ℃ SOX9基因引物退火溫度為56.6 , 72℃ ℃延伸 1min, 循環(huán)35次; 然后72℃再延伸10min; 4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 石蠟切片

將取出的另一半組織保存于 4%多聚甲醛內(nèi),室溫固定24h后轉(zhuǎn)入50%乙醇。在體視顯微鏡下進(jìn)行組織形狀修正, 經(jīng)過(guò)乙醇濃度由低到高梯度脫水,二甲苯透明, 純石蠟包埋, 進(jìn)行常規(guī)石蠟連續(xù)切片,以(5—6) μm厚度為宜。

1.6 蘇木精-伊紅染色

將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟, 乙醇梯度水分滲透,蘇木素-伊紅染色, 脫水, 封片。正置顯微鏡(OLYMPUS)下觀察拍照。

1.7 免疫熒光染色

脫蠟后切片放入 0.01 mol/L檸檬酸鈉溶液, 95℃抗原修復(fù) 20min, 冷卻至室溫。在封閉液(10%正常驢血清, 3%BSA, 0.1%Triton X-100, 0.01 mol/L PBS)中室溫孵育 1h, 吸去周邊多余液體, 分別加兔抗SOX9(1∶500)、DMRT1(1∶250)和鼠抗β-catenin (1∶250), 4℃過(guò)夜。用0.01 mol/L PBST和洗脫液(1%Normal Donkey Serum, 3%BSA, 0.1%Triton X-100, 0.01 mol/L PBS)清洗10 min×3; 在室溫避光環(huán)境下, 滴加羊抗兔IgG 488(1∶250)和羊抗鼠IgG 594(1∶250), 孵育1h, 用0.01 mol/L PBST和洗脫液清洗10min×4。滴加DAPI(286 nmol/L)液室溫避光染色5min, 0.01 mol/L PBS清洗5min×3。加抗熒光淬滅液封片, 于熒光正置顯微鏡拍照。

2 結(jié)果

2.1 雌二醇(E2)及芳香化酶抑制劑(AI)處理后的性腺組織形態(tài)學(xué)觀察

正常25期雄性(ZZ)性腺外形呈橢圓形, 皮質(zhì)區(qū)退化為單細(xì)胞層, 髓質(zhì)區(qū)發(fā)育, 原始性索形成, 并由大量的 Sertoli前體細(xì)胞圍繞原始生殖細(xì)胞組成(圖1A)。25期雌性(ZW)性腺外形呈傘狀, 皮質(zhì)區(qū)發(fā)育, 髓質(zhì)逐漸退化, 大量生殖細(xì)胞分布在皮質(zhì)區(qū)(圖1C)。ZZ性腺經(jīng)過(guò)E2處理后, 外形大致呈現(xiàn)傘狀, 比正常雌性稍大, 皮質(zhì)區(qū)明顯發(fā)育, 4—5層生殖細(xì)胞位于其中, 髓質(zhì)區(qū)明顯退化, 中間形成腔隙結(jié)構(gòu),此時(shí)的性腺具有明顯的雌性性腺特征(圖1B)。ZW性腺經(jīng)過(guò)AI處理后, 性腺結(jié)構(gòu)明顯雄性化, 皮質(zhì)區(qū)趨于退化, 髓質(zhì)區(qū)發(fā)育, 形成較明顯的原始性索,原始生殖細(xì)胞主要分布于髓質(zhì)區(qū)(圖1D)。

2.2 E2和AI對(duì)中華鱉胚胎雌雄比例的影響

中華鱉鱉胚經(jīng)過(guò)藥物處理后, 孵化出殼, 對(duì)性腺進(jìn)行H&E染色分析其生理性別比例。從表2可以看出, 鱉卵經(jīng)過(guò)藥物處理后, 孵化率沒(méi)有受到影響,仔鱉生長(zhǎng)正常。在對(duì)照組中, 雌雄比約為 1∶1, 雌性占出殼總數(shù)的 49.0%。E2處理組中, 雌性性別比例顯著增加, 高達(dá)92.3%。而在AI處理組中, 由于雌激素受到抑制, 雌性比例顯著下調(diào)至13.1%。該數(shù)據(jù)表明, 雌激素在中華鱉性腺分化中具有重要的調(diào)控作用。

2.3 E2和AI對(duì)DMRT1和SOX9基因mRNA表達(dá)的影響

為了確認(rèn)雌激素在中華鱉性腺分化中的作用, 本文還研究了E2和AI對(duì)性腺分化關(guān)鍵基因DMRT1和SOX9表達(dá)的影響。首先檢測(cè)了這兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平。如圖2所示: DMRT1和SOX9基因在正常雄性中高度特異性表達(dá), 在正常雌性中均不表達(dá)。經(jīng)過(guò)E2處理后, 雄性(ZZ)胚胎性腺中SOX9基因表達(dá)量下調(diào), DMRT1基因表達(dá)甚至消失。而雌性(ZW)胚胎經(jīng)過(guò)AI處理后, SOX9和DMRT1基因開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá), 但表達(dá)量均低于正常雄性。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在中華鱉性腺分化過(guò)程中, 雌激素能抑制雄性性腺分化關(guān)鍵基因DMRT1和SOX9的表達(dá)。

圖1 E2及AI處理后中華鱉性腺組織形態(tài)學(xué)觀察Fig. 1 Histological analysis of E2or AI-treated embryonic gonads in Pelodiscus sinensis

表2 E2及AI對(duì)中華鱉胚胎雌雄比例的影響Tab. 2 The effect of E2or AI on sex ratio of embryos in Pelodiscus sinensis

圖2 E2和AI對(duì)中華鱉SOX9和 DMRT1基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 2 Effects of E2or AI on the mRNA expressions of SOX9 and DMRT1 genes during gonadal differentiation in Pelodiscus sinensis

2.4 E2和AI對(duì)DMRT1和SOX9蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證雌激素能抑制 DMRT1和SOX9的表達(dá), 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光染色, 檢測(cè)性腺中DMRT1和SOX9蛋白在E2或AI處理后的表達(dá)情況。

中華鱉DMRT1蛋白在雄性性腺髓質(zhì)中大量表達(dá), 主要定位于性索中Sertoli前體細(xì)胞的細(xì)胞核中,并圍繞著原始生殖細(xì)胞(圖3A-D); 但在正常雌性性腺中未見(jiàn)表達(dá)(圖3I-L)。β-連鎖蛋白(Catenin)作為細(xì)胞黏附的重要調(diào)控因子, 與細(xì)胞膜上 cadherin蛋白結(jié)合, 參與細(xì)胞的黏附作用。在中華鱉性腺中, β-catenin蛋白主要位于雄性性腺髓質(zhì)區(qū)性索細(xì)胞以及雌性性腺皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞的細(xì)胞膜上(圖3B、J)。雄性胚胎經(jīng)過(guò) E2處理后, DMRT1蛋白表達(dá)消失, β-catenin蛋白在皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞中大量表達(dá), 呈現(xiàn)典型的雌性性腺結(jié)構(gòu)(圖3E-H)。雌性胚胎經(jīng)過(guò)AI處理后, DMRT1蛋白開(kāi)始在性腺髓質(zhì)區(qū)表達(dá); 除了皮質(zhì)區(qū), β-catenin蛋白在髓質(zhì)區(qū)也有少量表達(dá), 呈現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象(圖3M-P)。

如圖4所示, 在正常雄性中華鱉胚胎性腺中, SOX9蛋白主要在Sertoli前體細(xì)胞的細(xì)胞核中大量表達(dá), 充滿整個(gè)性腺髓質(zhì)區(qū)(圖4A-D); 雌性性腺中并未檢測(cè)到SOX9熒光信號(hào)(圖4I-L)。經(jīng)過(guò)E2處理后, 雄性性腺中 SOX9蛋白表達(dá)顯著下調(diào), 并且主要定位于皮質(zhì)區(qū)生殖細(xì)胞的周?chē)?xì)胞中, β-catenin蛋白主要分布于皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞中(圖4E-H)。雌性胚胎經(jīng)過(guò)AI處理后, SOX9蛋白表達(dá)顯著增加, 在髓質(zhì)區(qū)和皮質(zhì)區(qū)中均有分布; β-catenin蛋白亦在髓質(zhì)區(qū)和皮質(zhì)區(qū)中表達(dá)(圖4M-P)。

圖3 E2和AI處理后中華鱉性腺的DMRT1&β-catenin免疫熒光染色Fig. 3 DMRT1 & β-catenin immunofluorescence of E2or AI-treated gonads in Pelodiscus sinensis

圖4 E2和AI處理后中華鱉性腺的SOX9&β-catenin免疫熒光染色Fig. 4 SOX9 & β-catenin immunofluorescence of E2or AI-treated gonads in Pelodiscus sinensis

以上免疫熒光染色結(jié)果與 RT-PCR分析結(jié)果相一致, 表明雌激素的確能抑制DMRT1和SOX9的表達(dá), 促進(jìn)性腺向雌性方向分化。

3 討論

在除哺乳動(dòng)物外的大部分脊椎動(dòng)物中, 雌激素在早期性腺分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用, 主要表現(xiàn)在: 在雄性性腺分化期間施加外源性雌激素能拮抗遺傳因子或環(huán)境信號(hào), 誘導(dǎo)雄性向雌性的性別逆轉(zhuǎn)[22—24]; 而在雌性動(dòng)物性別決定前注射芳香化酶抑制劑能誘導(dǎo)雌性向雄性的性別逆轉(zhuǎn)[25—28]。本實(shí)驗(yàn)采用雌二醇(E2)與芳香化酶抑制劑(AI)在中華鱉性腺分化早期對(duì)胚胎進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn), E2處理組中雌性子代比例高達(dá) 92.3%, 性腺皮質(zhì)區(qū)發(fā)育, 髓質(zhì)區(qū)明顯退化, 向雌性性腺轉(zhuǎn)化; 而AI處理組中的雄性比例可達(dá)86.9%, 性腺結(jié)構(gòu)明顯雄性化。本研究表明雌激素信號(hào)在中華鱉雌性性別分化中起重要的調(diào)控作用。Wibbels, et al. 和Crews, et al.研究發(fā)現(xiàn), 雌激素和芳香化酶抑制劑均能誘導(dǎo)蜥蜴和巴西龜胚胎發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)[25,26]。Olmstead, et al.亦發(fā)現(xiàn)外源性芳香化酶抑制劑可誘導(dǎo)非洲爪蟾雌性性腺發(fā)育為雄性性狀[27]。這說(shuō)明, 在爬行動(dòng)物中, 雌激素在早期性別分化中的調(diào)控作用極可能是高度保守的。

雌激素對(duì)中華鱉雄性胚胎的雌性誘導(dǎo)作用雖然已經(jīng)確定, 但是關(guān)于其如何誘導(dǎo)雙向潛能性腺向雌性方向發(fā)育的分子機(jī)制還不清楚。在性別決定和性腺分化的關(guān)鍵基因中, DMRT1和SOX9基因是非常保守的雄性決定因子。DMRT1基因沉默的ZZ遺傳雄雞中出現(xiàn)了雌性化的卵巢組織[8], SOX9基因在小鼠胚胎性腺向睪丸分化中是必需和有效的, 其與雄性分化的相關(guān)性在脊椎動(dòng)物中呈現(xiàn)高度保守[29—31]。在巴西龜中, 向胚胎注射雌二醇能顯著抑制DMRT1和SOX9基因的表達(dá)[32]。另外, Durando, et al.發(fā)現(xiàn)雄性寬吻鱷胚胎進(jìn)行雌二醇處理后, SOX9表達(dá)顯著下降[33], 提示雌激素參與雄性性別決定因子的表達(dá)調(diào)控。我們前期研究發(fā)現(xiàn), DMRT1和SOX9基因在中華鱉性腺發(fā)育過(guò)程中呈高度雄性特異性表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中, 我們對(duì)中華鱉雄性和雌性胚胎分別進(jìn)行雌二醇(E2)和芳香化酶抑制劑(AI)處理, 結(jié)果顯示在E2組中DMRT1和SOX9 mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降, AI組中DMRT1和SOX9表達(dá)則急劇上升。這說(shuō)明雌激素通過(guò)抑制DMRT1和SOX9的表達(dá)來(lái)抑制雄性分化, 從而誘導(dǎo)雌性發(fā)育, 與Barske和Capel的研究結(jié)果相一致[34]。此外, Murdock 和Wibbels研究發(fā)現(xiàn) DMRT1在紅耳龜雄性性腺中的特異性表達(dá)早于 SOX9[35]。我們?cè)谇捌谘芯恐? 亦發(fā)現(xiàn)中華鱉DMRT1基因先于SOX9在雄性性腺中開(kāi)始表達(dá), 加上本實(shí)驗(yàn)中雌激素對(duì)DMRT1的抑制作用較SOX9基因明顯, 推測(cè)出龜鱉類(lèi)動(dòng)物的 DMRT1基因可能作用于SOX9的上游。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素通過(guò)抑制雄性性別關(guān)鍵因子DMRT1和SOX9的表達(dá)來(lái)抑制雄性分化,從而促進(jìn)雌性分化和卵巢發(fā)育, 揭示了雌激素在中華鱉雌性性別分化中的重要調(diào)控作用, 而關(guān)于中華鱉性別決定的具體分子機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

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THE EFFECTS OF ESTROGEN ON GONADAL DIFFERENTIATION AND EXPRESSIONS OF DMRT1 AND SOX9 IN PELODISCUS SINENSIS

WANG Li1,2, HU Tao1, MI Meng-Dong1,YANG Ke-Zhou1, QIAN Guo-Ying1,2and GE Chu-Tian1
(1. College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China; 2. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The molecular mechanism of sex determination in Pelodiscus sinensis has been a long-standing mystery. In many vertebrate species, estrogens play a key role in sex determination and gonadal differentiation. To investigate the effect of estrogens in the gonadal differentiation of P. sinensis and the underlying molecular mechanism, we treated the undifferentiated embryos with 17β-estradiol (E2) and aromatase inhibitor (AI). Results showed that the female ratio increased by 92.3% after E2treatment, whereas female ratio in AI treatment group decreased dramatically to 13.1%. Meanwhile, the obvious masculinization of genetically female embryos and feminization of genetically male embryos were observed after AI and E2treatment, respectively. Moreover, RT-PCR and immunofluorescence analysis showed that E2could significantly downregulated mRNA and protein expressions of DMRT1 and SOX9, which were the key factors involving in male development. However, AI exerted the opposite effect. In conclusion, estrogens inhibited the male development via the inhibition of expression of DMRT1 and SOX9, and consequently led to female development, indicating the important role of estrogens in the female sexual differentiation in Pelodiscus sinensis.

Estrogens; DMRT1; SOX9; Sexual differentiation; Gonadal development; Pelodiscus sinensis

Q344+.1

A

1000-3207(2014)03-0467-07

10.7541/2014.66

2013-08-29;

2013-12-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(31101884); 973計(jì)劃前期專(zhuān)項(xiàng)(2011CB111513); 浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(2013C32054);寧波市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2012B82016); 寧波市自然科學(xué)基(2012A610142)資助

王莉(1987—), 女, 山西呂梁人; 碩士研究生; 主要從事龜鱉類(lèi)性別決定研究。E-mail: wlerdans@gmail.com

葛楚天(1983—), 男, 浙江寧海人; 博士, 副教授, 碩士生導(dǎo)師; 主要研究為動(dòng)物生殖生物學(xué)。E-mail: cge@zwu.edu.cn