青光眼視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究進(jìn)展△

吳姍姍 田慶梅 高延娥 畢宏生

青光眼是一組不可逆性、年齡相關(guān)性致盲性眼病，主要臨床特征是視神經(jīng)退行性病變引起的視野缺損、視力下降，最終導(dǎo)致單眼或雙眼視力完全喪失。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，截至2020年，青光眼所致雙盲人數(shù)在世界范圍內(nèi)將達(dá)到1120萬。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)終末分支的神經(jīng)元，在青光眼發(fā)病中，其進(jìn)行性不可逆性凋亡引起視野缺損和視力下降。RGC可通過死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑發(fā)生凋亡，以下就這幾種凋亡途徑作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 青光眼RGC凋亡調(diào)控和相關(guān)信號(hào)

RGC凋亡調(diào)控涉及凋亡相關(guān)信號(hào)及其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因和酶的調(diào)節(jié)。青光眼發(fā)病中多種危險(xiǎn)因素如高眼壓、血流動(dòng)力學(xué)障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等均可導(dǎo)致RGC凋亡。

通常認(rèn)為，導(dǎo)致細(xì)胞損傷的因素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如高眼壓、血流動(dòng)力障礙、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、興奮性谷氨酸毒性作用、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等均可作為凋亡調(diào)控相關(guān)信號(hào)導(dǎo)致RGC凋亡。

青光眼高眼壓擠壓視神經(jīng)，造成視神經(jīng)缺血缺氧，導(dǎo)致無氧糖酵解乳酸脫氫酶和轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和p-cJun上調(diào)，通過JNK途徑引起RGC

凋亡[2]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)發(fā)病機(jī)制中起重要作用，可導(dǎo)致腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)顯著升高[3]，誘導(dǎo)RGC通過死亡受體途徑凋亡。研究表明[4]，谷氨酸毒性介導(dǎo)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體過表達(dá)，引起視網(wǎng)膜抗凋亡因子Bcl-2、視網(wǎng)膜中最重要的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達(dá)下降和促凋亡因子Bax、凋亡相關(guān)酶caspase-3表達(dá)增加，引起RGC凋亡。Dekeyster等[5]研究表明，RGC缺乏BDNF支持是其退化和死亡的重要原因。當(dāng)BDNF被剝奪可激活促凋亡基因Bax，引起線粒體功能障礙[6]。

最近研究表明，咖啡及其主要成分綠原酸(chlorogenic acid，CGA)可顯著減少缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，并可預(yù)防視網(wǎng)膜變性[7]。Mg乙?；；撬猁}(Mg acetyltaurate，MgAT)即Mg和?；撬岬慕M合[4]，或溴莫尼定局部給藥，可降低谷氨酸興奮毒性[8]。抗炎藥物米諾環(huán)素[9]或TNF-α抗體[10]可抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生。由此可見，可通過減少青光眼RGC凋亡相關(guān)信號(hào)來阻止或延緩RGC凋亡。

2 青光眼RGC凋亡通路

青光眼RGC凋亡通過細(xì)胞死亡受體途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因，如Bcl-2、Bax、caspase等激活，并引起細(xì)胞凋亡，主要以前2種通路為主。以下是青光眼RGC凋亡相關(guān)調(diào)控機(jī)制及3種凋亡途徑在青光眼RGC凋亡中的作用機(jī)制。

2.1 死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路死亡受體(death receptor，DR)途徑是相對(duì)成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目前研究較多的為凋亡相關(guān)因子(factor associated suicide，F(xiàn)as)和腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)。

2.1.1 Fas受體通路Fas(CD95)是TNF/NGF受體家族的膜蛋白，相應(yīng)的Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)屬于胞外TNF超家族成員，在免疫特權(quán)位置如眼上表達(dá)。FasL誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞表達(dá)其受體Fas，二者結(jié)合使受體三聚化并活化，通過Fas分子的死亡結(jié)構(gòu)域募集銜接蛋白，如TNF受體結(jié)合死亡域(TNF receptor associated death domain，TRADD)或Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas associated death domain，F(xiàn)ADD)。銜接蛋白可通過死亡效應(yīng)域與caspase-8前體(pro-caspase8)形成由FasL-Fas-FADD-procaspase-8串聯(lián)構(gòu)成的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(death-inducing signal complex，DISC)。在DISC內(nèi)，高濃度的procaspase-8可以自我剪接和活化，然后釋放到胞質(zhì)并啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)活化的caspase-8還能激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid，使之形成一種截短的Bid(truncated Bid，tBid)[11]，tBid轉(zhuǎn)移到線粒體并破壞線粒體膜的通透性，釋放凋亡因子細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyto-C)、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1)到胞質(zhì)中，從而將死亡受體途徑和線粒體途徑連接起來，有效擴(kuò)大凋亡信號(hào)的作用。

2.1.2 TNF受體通路研究表明，TNF-α可介導(dǎo)RGC死亡[12]。青光眼患者的離體眼視網(wǎng)膜中可發(fā)現(xiàn)TNF-α、TNFR1及兩者所誘發(fā)的信號(hào)通路有關(guān)蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，且在慢性高眼壓鼠模型中發(fā)現(xiàn)房水、視網(wǎng)膜中的TNF-α表達(dá)明顯增加[13]。

當(dāng)視網(wǎng)膜缺血、眼壓升高或神經(jīng)退行性變時(shí)，TNF-α、TNFR1表達(dá)增加，TNFR1通過TRADD募集FADD、TNF受體相關(guān)因子2 (TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)、受體作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)等，TRAF2、RIP通過下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB)從而抑制細(xì)胞凋亡。但青光眼中，TNF-α促使RGC中JNK信號(hào)通路持續(xù)活化，進(jìn)而抑制NF-kB激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。此外，TNF-α還激活caspase-8引起一系列蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2.2 線粒體介導(dǎo)的凋亡通路線粒體可通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量(ATP)，為滿足代謝活躍的視網(wǎng)膜提供能量保證，視神經(jīng)軸突線粒體豐度表明RGC對(duì)代謝和ATP有極高要求[15]。此外，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑在青光眼視網(wǎng)膜RGC的凋亡中起重要作用。研究表明[16]，使用基因工程小鼠證明急性(即軸索切斷術(shù))和慢性(實(shí)驗(yàn)性青光眼)視神經(jīng)損害引起的RGC凋亡主要涉及線粒體功能障礙的內(nèi)在途徑。

線粒體具有獨(dú)特且動(dòng)態(tài)的質(zhì)量控制系統(tǒng)，易融合、分裂[17]。細(xì)胞和環(huán)境的變化誘導(dǎo)線粒體裂變，表示細(xì)胞凋亡的早期跡象[18]。凋亡誘導(dǎo)信號(hào)如射線、化學(xué)治療藥物和氧化應(yīng)激及鈣穩(wěn)態(tài)失衡等可作用于線粒體膜，使其跨膜電位明顯下降和膜轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致線粒體膜通透性增高，促使線粒體內(nèi)凋亡啟動(dòng)因子[如Cyto-C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF和Apaf-1等]釋放至胞質(zhì)，Cyto-C在三磷酸脫氧腺苷(dATP)存在的情況下，與Apaf-1和caspase-9前體(procaspase-9)結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，導(dǎo)致procaspase-9激活，后者通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游caspase-3、caspase-6和caspase-7前體等，活化的caspase作用于細(xì)胞骨架蛋白等導(dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)功能喪失、核酸內(nèi)切酶激活和DNA片段化等引起細(xì)胞凋亡。AIF通過促進(jìn)線粒體釋放Cyto-C而增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)，從而形成線粒體凋亡途徑的惡性循環(huán)，促使RGC細(xì)胞凋亡。

2.2.1 線粒體Bcl-2抗凋亡基因Bcl-2家族是主要的凋亡相關(guān)基因家族，包括抗凋亡成員(如Bcl-2和Bcl-XL)和促凋亡成員(如Bax和Bak)，它們之間的比例決定細(xì)胞的命運(yùn)[19]。所有家族成員共享4個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)，稱為Bcl-2同源域(Bcl-2 homeodomain，BH)。僅含BH3結(jié)構(gòu)域(BH3-only)的蛋白是細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)的第一反應(yīng)者，具有不同水平的促凋亡作用活動(dòng)。Bcl-2蛋白通過螯合活化劑BH3蛋白或Bax、Bak來抑制線粒體外膜透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)，阻止Cyto-C和AIF從線粒體釋放出來[20]，從而抑制RGC凋亡。

2.2.2 線粒體Bax促凋亡基因Bax是青光眼RGC死亡所必需的[21]，是細(xì)胞凋亡的中樞激活劑[22]。Bax形成細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)處的單項(xiàng)通道，所以許多不同的凋亡途徑必須通過這個(gè)節(jié)點(diǎn)[23]，其激活后產(chǎn)生的一系列反應(yīng)通常被認(rèn)為是細(xì)胞死亡過程中不可逆轉(zhuǎn)的過程。Bax主要位于胞質(zhì)穩(wěn)態(tài)環(huán)境中，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)誘導(dǎo)時(shí)便異位到線粒體外膜(mitochondrial outer membrane，MOM)上[24]。BH3-only蛋白和Bax活化位點(diǎn)的相互作用是激活Bax的關(guān)鍵步驟，活化后，Bax優(yōu)先與其他Bax或Bak分子BH3結(jié)構(gòu)域形成二聚體單元[25]。研究表明[26]，Bax二聚體在線粒體外膜上打孔，使Cyto-C和其他的促凋亡因子釋放出來，引起線粒體途徑細(xì)胞凋亡。

BH3-only蛋白通過結(jié)合或中和抗凋亡蛋白Bcl-2成員或通過直接激活Bax或Bak啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致RGC凋亡。所以BH3結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐cl-2家族蛋白質(zhì)之間的相互作用以及促凋亡和抑制凋亡之間的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，RGC中影響細(xì)胞凋亡的最重要變化可能是BH3-only蛋白表達(dá)的增加。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic network，ER)是檢測(cè)環(huán)境變化、細(xì)胞應(yīng)激、協(xié)調(diào)信號(hào)通路和控制細(xì)胞功能和生存的細(xì)胞器，主要功能是幫助蛋白質(zhì)正確折疊、成熟和準(zhǔn)確運(yùn)輸[27]。

研究表明，ER應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病中的青光眼RGC死亡有關(guān)[28]。不同的病理生理?xiàng)l件，如營養(yǎng)缺乏、氧化還原狀態(tài)的變化和病毒感染等均可以影響ER的功能，這導(dǎo)致蛋白質(zhì)不折疊或錯(cuò)誤折疊，并且該蛋白質(zhì)在ER腔中累積并因此增加ER壓力。未折疊的蛋白質(zhì)形成不溶性蛋白質(zhì)，聚集并產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒的沉淀，從而引起一種自適應(yīng)機(jī)制激活，稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)。參與UPR反應(yīng)的其中一種蛋白是肌醇依賴酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，RE1α)，它通過激活細(xì)胞凋亡信號(hào)激酶-1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)和下游JNK、p38 MAPK[29]，使抗凋亡標(biāo)志物Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bim上調(diào)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑是神經(jīng)退行性疾病青光眼中RGC凋亡的重要途徑之一[30]。

2.4 半胱天冬酶半胱天冬酶(caspase)又稱凋亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，分為啟動(dòng)型半胱天冬酶和效應(yīng)型半胱天冬酶兩類，前者包括caspase-8、caspase-9、caspase-10，后者包括caspase-3、caspase-6和caspase-7。啟動(dòng)型半胱天冬酶通過催化裂解效應(yīng)型激活域引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[31]。在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)退行性疾病中，RGC凋亡是caspase依賴型[32]。caspase是細(xì)胞凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分，可被外源性和內(nèi)源性的凋亡途徑激活。外源性凋亡信號(hào)與死亡受體Fas結(jié)合激活caspase級(jí)聯(lián)酶解反應(yīng)，內(nèi)源性凋亡途徑是由線粒體[33]和細(xì)胞內(nèi)的損傷(包括DNA損傷和丟失細(xì)胞外膜完整性)激活。caspase經(jīng)上述機(jī)制激活后，通過滅活凋亡抑制蛋白(如Bcl-2)，打通細(xì)胞凋亡分子機(jī)制通道；水解或切割細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)和瓦解核結(jié)構(gòu)等引起細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征性變化，最終形成凋亡小體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[34]。

3 小結(jié)

青光眼RGC凋亡是由體內(nèi)外相關(guān)凋亡信號(hào)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序，啟動(dòng)凋亡相關(guān)通路導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程。基于以上分析，多種凋亡通路參與RGC凋亡，線粒體凋亡通路起重要作用，促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2之間的比例變化引起一系列凋亡因子釋放，稱為線粒體凋亡途徑的始動(dòng)環(huán)節(jié)。死亡受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑也參與其中，多種通路相互關(guān)聯(lián)、相互作用同時(shí)引發(fā)caspase激活，通過一系列caspase級(jí)聯(lián)酶解反應(yīng)，最終觸發(fā)核酸內(nèi)切酶，引起RGC凋亡，其任一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙均可促進(jìn)和導(dǎo)致青光眼疾病的發(fā)生。但參與RGC凋亡的具體分子信號(hào)途徑目前尚未明確，探索分子途徑上下游信號(hào)及其作用尤為重要。目前人們正針對(duì)凋亡發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)探索調(diào)控細(xì)胞凋亡速度的方法和措施，以達(dá)到防治青光眼的目的。