不同產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材水溶性成分指紋圖譜研究

盛 萍，安露莎，苗莉娟，姚 藍，2，史 紅，2，張 煊

(1.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011 )

伊貝母是《中華人民共和國藥典》收載的、常用名貴大宗藥材，為百合科植物新疆貝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁貝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鱗莖。自1977年始收載在《中華人民共和國藥典》歷次版本中。性微寒，味苦，歸肺、心經(jīng)。具有清熱潤肺，化痰止咳之功效。臨床上常用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞咳，咳痰帶血等癥[1]。在臨床應(yīng)有方面與藥材川貝母相同，是中醫(yī)處方和中成藥生產(chǎn)常用的名貴藥材。其野生品種僅分布在中國新疆境內(nèi)[2-3]，為國家三級重點保護野生藥材。由于野生伊貝母藥材資源破壞嚴重，目前伊貝母資源在低山帶已經(jīng)絕跡，中山帶僅在灌木叢中零星分布。伊貝母人工栽培自20世紀70年代開始引種成功，而大量投入生產(chǎn)、商品供應(yīng)市場，是從90年代中末期開始，目前大規(guī)模種植伊貝母產(chǎn)業(yè)已成為拉動新疆當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民收入的重要途徑。近年伊貝母作為我區(qū)道地藥材的種植面積逐漸擴大, 而這一舉措也有效緩解了伊貝母藥材市場供應(yīng)的緊張局面。

伊貝母的主要活性成分為生物堿、皂苷類成分[4]，目前對伊貝母的研究主要集中在生物堿成分方面[5-10]，對生物堿指紋圖譜的研究也有報道[11]，而對其水溶性成分研究甚少[12]。近年研究表明，貝母中水溶性成分主要為核苷和腺苷(adenosine) ，具有抗炎、抑制血小板凝聚、降壓、松弛平滑肌等作用[13-14]，而貝母的抗炎作用能協(xié)同治療呼吸道感染，是貝母止咳化痰的藥理學(xué)基礎(chǔ)[15]。但在2010版《中國藥典》(一部)僅給出了伊貝母西貝母堿、西貝母堿苷含量測定質(zhì)量控制指標，這對于藥材內(nèi)在質(zhì)量的評價存在一定的局限性。

因此，本文采用HPLC技術(shù)結(jié)合相似度分析方法，對不同產(chǎn)地野生與栽培29批伊貝母藥材的水溶性指紋圖譜進行了系統(tǒng)的研究，以期為進一步控制其質(zhì)量，促進伊貝母藥材的栽培和開發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。

1 儀器與材料

日本島津LC-20AT型高效液相色譜儀，包括LC-20AT四元泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器；TGL-16G臺式離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。色譜級甲醇(Fisher Scientific)，水為屈臣氏水，其他試劑均為分析純。

本實驗所用野生與栽培伊貝母藥材均采自藥材主產(chǎn)地新疆霍城縣、溫泉縣、鞏留縣、新源縣、烏蘇縣、呼圖壁縣、米泉、吉木薩爾縣、奇臺縣、木壘縣等不同產(chǎn)地，伊貝母藥材樣品信息見表1。經(jīng)鑒定為百合科植物新疆貝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁貝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鱗莖。憑證標本存放于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室。藥材經(jīng)60 ℃烘干后粉碎，過80目篩，備用。對照品腺苷(批號110879-200202，Adenosine)，購于中國藥品生物制品檢定所；β-胸苷(批號89270-1G，Thymidine，SIGMA-ALDRICH)，純度均大于99.0%。

表1 不同產(chǎn)地伊貝母藥材品種及HPLC指紋圖譜共有峰的相似度

續(xù)表1

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相：A(甲醇)-B(水)梯度洗脫：0～20 min(B 93%)；20～25 min(B 93%～80%)；25～55 min(B 80%～70%)；55～80 min(B 70%～50%)；80～90 min(B 50%～30%)；90～100 min(B 30%～20%)。流速0.5 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長260 nm；進樣量15 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品β-胸苷、腺苷各5.75 mg，加水制成每mL含腺苷0.115 0 mg，β-胸苷0.011 50 mg的溶液，加水超聲溶解，即得標準品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末1.5 g，置50 mL錐形瓶中，精密加水10 mL，混勻，稱重，室溫下超聲提取60 min(50 kHz)，取出，放冷，補足失重，搖勻，倒入離心管中，離心5 min(10 000 r·min-1)，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液(S1)，按2.1項下方法連續(xù)進樣6次進行檢測，以5號峰β-胸苷為參照峰計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.56%，表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同批樣品(S1) 6份，按2.2.2項下方法平行制備供試品溶液，進行測定。以5號峰β-胸苷為參照峰計算各共有峰相對保留時間和相對保留分房面積的RSD均小于2.45%，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(S1)，分別在0，2，4，8，12，24，36，48 h進行測定，以5號峰β-胸苷為參照峰計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.90%，說明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 β-胸苷和腺苷線性關(guān)系考察

分別精密吸取標準品溶液β-胸苷5、10、20、30、40、50 μL，標準品溶液腺苷2、4、6、8、10、12、14、16 μL注入HPLC儀，按2.1項下條件及方法測定色譜峰面積，以色譜峰面積為應(yīng)變量y，濃度為自變量x(μg/μL)，進行線性回歸，得β-胸苷的回歸方程為Y=5.786 2×106X+8 578.8，r=0.999 9，表明β-胸苷在0.057 5～0.575 μg·μl-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；得腺苷的回歸方程為Y=6.506 95×106X+44 612.7，r=0.999 9，表明腺苷在0.23～1.84 μg·μl-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 HPLC指紋圖譜中的特征峰

在2.1項色譜條件下，對29批不同產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材樣品進行檢測，比較各樣品色譜圖的檢測結(jié)果, 標定了14個主要共有峰，其中指認了5號峰為β-胸苷，7號峰為腺苷。共有峰面積占所有峰面積的百分比為79.8%～95.6%。29批伊貝母藥材樣品HPLC指紋圖譜見圖1。

圖1 不同產(chǎn)地伊貝母藥材HPLC指紋圖譜圖

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 指紋圖譜的建立及相似度評價 從新疆各產(chǎn)地采集的野生與栽培伊貝母藥材樣品，記錄其指紋圖譜(圖1)，并將所得的29批伊貝母藥材樣品色譜圖依次導(dǎo)入國家藥典會編寫的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A 版》軟件，對從不同產(chǎn)地野生與栽培的伊貝母藥材的指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理, 生成對照指紋圖譜(圖2), 不同產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材的相似度見表1。除了批號S1，S4，S5，S7，S8，S9，S17的相似度在0.8以下較低外，其余不同產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材指紋圖譜的相似度均較高，見表2。

表2 29批伊貝母藥材樣品β-胸苷和腺苷測定結(jié)果(n=3)

2.6.2 指紋圖譜系統(tǒng)聚類分析 將29批不同產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材的HPLC指紋圖譜14個共有色譜峰的峰面積與藥材稱樣量相比，即對單位質(zhì)量藥材峰面積進行量化，得到29×14階的數(shù)據(jù)矩陣，應(yīng)用SPSS 18.0分析軟件，采用Ward方法和卡方度量進行聚類分析，分析結(jié)果見圖3。圖3為全部29個藥材樣本的聚類圖。依據(jù)聚類圖，在相似距離為10處，有5個分支組。分支組Ⅰ包括不同產(chǎn)地的(米泉縣、吉木薩爾縣、瑪納斯縣、沙灣縣、烏蘇縣巴音溝)新疆貝母野生藥材樣本(1，2，5，6，9) 和不同產(chǎn)地的(奇臺縣、烏蘇縣白楊溝、新源縣、霍城縣)新疆貝母野生與栽培的藥材樣本(3, 7，14，15)，其中15從霍城縣購買的樣本很可能是新源縣栽培的新疆貝母，故能很好地聚在一起；分支組Ⅱ包括兩個產(chǎn)地伊犁州鞏留縣、新源縣伊犁貝母栽培樣本(10，11，23, 25，26，27，28)，其中10、11從藥業(yè)公司和藥店購買的樣本很可能就是這兩個產(chǎn)地栽培的伊犁貝母；分支組Ⅲ包括了不同產(chǎn)地的(溫泉縣、霍城縣果子溝、霍城縣蘆草溝)伊犁貝母野生與栽培的藥材樣本(18，19，17，21)，其中栽培的21號樣本生長環(huán)境(霍城縣蘆草溝)與其野生生長環(huán)境(溫泉縣、霍城縣)大體相同，故能很好地聚在一起；分支組Ⅳ包括不同產(chǎn)地的(呼圖壁縣、烏蘇縣白楊溝、新源縣、伊犁賽里木湖)新疆貝母野生與栽培的藥材樣本(4，8，12, 13，16)和伊犁貝母野生的藥材樣本 (20)；分支組Ⅴ由不同產(chǎn)地的(鞏留縣、溫泉縣)伊犁貝母栽培的藥材樣本 (22, 24，29) 組成，其中溫泉縣伊犁貝母栽培的種苗一般均從大規(guī)模種植產(chǎn)地鞏留縣購買，故其內(nèi)在質(zhì)量相似性、穩(wěn)定性較好。在相似距離為15處，有4個分支組，除了分支組Ⅰ包括了在相似距離為10處時的分支組Ⅰ和Ⅱ外，其余分支組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別對應(yīng)在相似距離為10處時的分支組Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。從整個聚類圖可看出，29個藥材樣本先根據(jù)品種的野生與栽培分別聚類，再根據(jù)品種(新疆貝母、伊犁貝母)聚在一起，雖然不同產(chǎn)地、野生與栽培藥材成分的個體差異有所不同，但不同產(chǎn)地、野生與栽培的藥材指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌很相似。

5.β-胸苷 7.腺苷

2.7 β-胸苷和腺苷測定

按2.2.2項下方法制備供試品溶液，對29 批伊貝母樣品中β-胸苷和腺苷進行測定，檢測波長260 nm，每批樣品溶液平行測定3 次。以平均相對峰面積按標準曲線方程法計算各批次樣品中β-胸苷和腺苷質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表2。

圖3 不同產(chǎn)地伊貝母藥材HPLC指紋圖譜聚類圖

3 討 論

3.1 分別比較了流動相乙腈-水、甲醇-水的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水效果較好，色譜圖基線平穩(wěn)，出峰數(shù)目及分離度都比較理想，最終確定了甲醇-水流動相及其洗脫梯度。分別比較了Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Hypersil C18色譜柱(4. 6 mm×250mm，5 μm)，以Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分離度好，色譜峰對稱性好，基線平穩(wěn)。采用DAD檢測器對樣品在200～400 nm波段范圍內(nèi)進行掃描，綜合考慮不同波長下色譜峰的數(shù)目、峰面積大小、色譜峰分離度及紫外，因此最終選擇260 nm為最佳測定波長。

3.2 中藥多以水煎劑為主, 其水溶性成分的藥理藥效研究已受到一定的關(guān)注。貝母中水溶性成分主要為核苷和腺苷。為了盡可能的體現(xiàn)伊貝母藥材所含水溶性化學(xué)成分的特征，以提取效率、β-胸苷和腺苷的總量為考察指標, 以提取溫度、甲醇和水的體積比、提取時間和溶劑用量為考察因素,采用單因素和L9(34)正交試驗優(yōu)選了伊貝母水溶性成分的最佳提取工藝，最終確定提取方法為10 mL水超聲提取60 min。

3.3 本文首次建立了伊貝母藥材水溶性成分HPLC指紋圖譜測定方法。該方法能使伊貝母藥材水提取物中大部分化學(xué)成分得到較好的分離，且精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，為伊貝母藥材的質(zhì)量綜合評價提供一定參考依據(jù)。

3.4 對29批采自新疆主要產(chǎn)地野生與栽培的伊貝母藥材樣品進行了水溶性成分HPLC指紋圖譜分析，確定了14個共有色譜峰。根據(jù)各色譜峰的波譜特征，結(jié)合貝母類藥材水溶性成分文獻[16]報道可知，該指紋圖譜中主要成分為核苷類成分。根據(jù)樣品峰保留時間鑒定了第5、7號色譜峰分別對應(yīng)為β-胸苷和腺苷。

3.5 首次對29 批不同產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材水溶性成分HPLC指紋圖譜進行了相似度計算和聚類分析。根據(jù)29個產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材的分析結(jié)果可看出，不同產(chǎn)地、野生與栽培的其藥材指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，除了批號S1，S4，S5，S7，S8，S9，S17的相似度在0.8以下較低外，其余不同產(chǎn)地野生與栽培伊貝母藥材指紋圖譜的相似度均較高。說明不同產(chǎn)地栽培伊貝母藥材質(zhì)量有較好的相似性。其中，相似度較低的樣本均為野生品種，說明野生品種所處的生長環(huán)境對藥材的內(nèi)在質(zhì)量有較大的影響。聚類分析表明，29個藥材樣本先根據(jù)品種的野生與栽培分別聚類，再根據(jù)品種(新疆貝母、伊犁貝母)聚在一起。如在相似距離為10處，分支組Ⅰ先與不同產(chǎn)地的新疆貝母野生藥材樣本聚類，再與不同產(chǎn)地的新疆貝母野生與栽培的藥材樣本；在相似距離為15處，分支組Ⅰ包括了不同產(chǎn)地新疆貝母野生與栽培藥材樣本。又如在相似距離為10處，分支組Ⅱ包括新疆伊犁州兩個大規(guī)模種植伊犁貝母的產(chǎn)地：鞏留縣和、新源縣藥材樣本；分支組Ⅲ包括了不同產(chǎn)地的伊犁貝母野生與栽培的藥材樣本。同時聚類分析結(jié)果進一步表明，伊貝母栽培藥材的質(zhì)量較穩(wěn)定可控。雖然不同產(chǎn)地、野生與栽培藥材成分的個體差異有所不同，但不同產(chǎn)地29批野生與栽培的藥材指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌很相似，可作為伊貝母藥材的特征指紋圖譜。

3.6 雖然不同批次，不同產(chǎn)地野生與栽培藥材指紋圖譜中主要化學(xué)成分的整體圖貌基本一致，但β-胸苷和腺苷含量差異較大(0.03～0.29之間；1.84～7.28之間)，這可能與不同產(chǎn)地土壤因子、氣候因子、干燥、加工等因素有關(guān)。因此有必要在指紋圖譜評價基礎(chǔ)上盡可能增加有效成分的定量測定，進一步評價藥材質(zhì)量。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典:一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：132.

[2] 中國植物志編輯委員會.中國植物志:第14卷[M].北京：科學(xué)出版社，1980：102.

[3] 新疆生物土壤沙漠研究所.新疆藥用植物志[M].烏魯木齊：新疆人民出版社，1977：186-199.

[4] 李萍，季暉，徐國鈞，等.貝母類中藥的鎮(zhèn)咳祛痰作用研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,1993,24(6):360-362.

[5] 劉慶華,賈曉光,任永風(fēng),等.新疆貝母化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報,1984,19(12):894-898.

[6] 黃恩垚,李超生,徐東銘.伊貝母生物堿成分的研究[J].中國中藥雜志,1990,15(9):39-41.

[7] 徐雅娟,徐東銘,黃恩喜,等.伊貝辛的分離和鑒定[J].藥學(xué)學(xué)報,1992,27(2):121-124.

[8] 李松林,李萍,曾令杰.伊犁貝母中西貝素和西貝素苷的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[J].藥學(xué)學(xué)報,2001,36(4):300-302.

[9] Li P, Zeng L J, Li S L, et al. The extraction of imperialine and imperialine-3 beta-glucoside from Fritillaria pallidiflora Schrenk and quantitative determination by HPLC-evaporative light scattering detection[J]. Phytochemical Analysis,2002,13(3):158-161.

[10] 王林輝,季暉,王長禮,等.伊犁貝母總生物堿的藥效學(xué)研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2003,34(2):172-176.

[11] 蔡曉翠,賀金華,徐芳,等.新疆道地藥材伊貝母HPLC-ELSD指紋圖譜研究及西貝母堿的含量測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(21):82-85.

[12] 陳澤,陸陽,徐佩娟,等.中藥貝母中水溶性成分的研究[J].中國中藥雜志,1996,21(7):420-422.

[13] Kang D G, Sohn E J, Lee Y M,et al. Effects of bulbus Fritillaria wanter extract on blood pressure and renal function in the L-NAME-induced hypertensive rats[J]. J Ethnopharmacol,2004,91(1):51-53.

[14] 黃麗晶,高文遠,李霞,等.平貝母水提物抗炎作用研究[J].天津中醫(yī)藥,2009,26(6):495-496.

[15] 鄒岡.基礎(chǔ)神經(jīng)藥理學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1988，310.

[16] 段寶忠，陳士林，魏大華，等.暗紫貝母水溶性成分HPLC指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志,2012,37(13):1990-1993.