黃連副產(chǎn)物中生物堿含量測(cè)定及提取工藝研究

高 倩，羅旭梅，龐 婕，代 姝，王德珍，李學(xué)剛,2*

(1.西南大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市黃連工程技術(shù)中心，重慶 400716)

黃連是毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch)的根莖，味苦、性寒，人心、肝、胃、大腸經(jīng)，有清熱燥濕，瀉火解毒的功能[1]，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。黃連栽培成本比較高，如果能將黃連的須根和莖葉也充分利用，不僅更有效地利用了資源，也減少了生產(chǎn)成本[2]。近年研究證明，黃連須和黃連葉均含有不同程度的黃連生物堿，黃連須根含3%的生物堿[3]，現(xiàn)代藥理研究表明，黃連主要有效成分生物堿類不僅具有抗菌、抗病毒的功效，還具有降血糖、降血脂、抗血小板凝集等藥理作用[4]。已經(jīng)有些單位開(kāi)始將這些部位用于魚和禽的飼料添加劑，防治易發(fā)傳染病，證明確實(shí)有效，但目前的利用量還不足實(shí)際產(chǎn)量的1/10，仍舊需要加大研究和利用力度。

黃連生產(chǎn)副產(chǎn)物包括黃連葉、黃連葉柄、黃連須等。在黃連收獲時(shí)，黃連地需要“亮棚”(去掉遮陰棚)，強(qiáng)光直接照射到植株上，黃連植株中所含的營(yíng)養(yǎng)成分等將向根莖轉(zhuǎn)移。黃連葉柄和須根中生物堿如何分布，作者目前尚無(wú)見(jiàn)到相關(guān)的研究報(bào)道。黃連采收時(shí)，部分葉柄和須根丟棄在田中，部分葉柄和須根隨黃連一起進(jìn)入下游加工并最后進(jìn)入灰渣。搞清楚黃連生物堿在葉柄和須根中的分布，對(duì)于黃連副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用，具有重要的參考價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC分析監(jiān)測(cè)技術(shù)，系統(tǒng)研究了黃連生物堿在5年生黃連葉、柄及須根中的分布，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)探求黃連副產(chǎn)物中總生物堿的最佳提取工藝,為充分提高黃連資源的利用率[5]及新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1儀器日本島津LC-20AD高效液相色譜儀。

1.2材料與試藥黃連生產(chǎn)副產(chǎn)物來(lái)源于重慶石柱縣；鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，11713-200911)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連生物堿含量測(cè)定[6]

2.1.1 色譜條件 色譜柱Hypersil ODS2高效液相色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(50∶50)；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末(過(guò)2號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合液50 mL，密塞并稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min。放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，緊密量取續(xù)濾液2 ～10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿1 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為10 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 黃連加工副產(chǎn)物中黃連生物堿含量測(cè)定

2.2.1 樣品含量的測(cè)定 精密稱取藥材粉末0.2 g，按“2.1.2”的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，按“2.1”的色譜條件依次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃連加工廢棄物生物堿含量

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取取同一樣品溶液，按“2.1”的色譜條件重復(fù)測(cè)定總生物堿含量6次，RSD為0.13 %，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液6份，按“2.1”的色譜條件重復(fù)測(cè)定總生物堿含量，RSD為0.72%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液3份，分別置于高溫、高濕、光照的條件下24小時(shí)后測(cè)定總生物堿含量，RSD為0.21%，結(jié)果表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取4份同一樣品溶液0.5 ml，向其中加入1.0 ml鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的回收率，小檗堿平均回收率為94.925%；RSD為1.51%(n=4)。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 酸度(V/V)[7-8]對(duì)黃連生物堿提取的影響 準(zhǔn)確稱取黃連須樣品25 g,在料液比為1:15，硫酸濃度分別為0%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的條件下回流提取1 h，結(jié)果如圖1所示，硫酸濃度為1.0%提取效果最好。

圖1 酸度對(duì)黃連生物堿提取的影響

2.3.2 料液比對(duì)黃連生物堿提取的影響 準(zhǔn)確稱取黃連須樣品25 g在硫酸濃度1.0%，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的條件下試驗(yàn)，回流提取1 h，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，1∶15的料液比提取效果最佳。

圖2 料液比對(duì)黃連生物堿提取的影響

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)黃連生物堿提取的影響 準(zhǔn)確稱取黃連須25 g在硫酸濃度1.0%，料液比為1∶15，在提取時(shí)間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h的條件進(jìn)行回流提取試驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示。提取時(shí)間為1 h時(shí)生物堿含量達(dá)到最大提取率最高，而1 h后生物堿含量逐漸降低，所以綜合考慮成本和生產(chǎn)周期，以回流提取1 h為佳。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃連生物堿提取的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響黃連生物堿提取的主要因素：硫酸濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)進(jìn)行正交試驗(yàn)[9]，以測(cè)得的樣品溶液中黃連總生物堿含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝條件。因素水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 黃連生物堿提取工藝的因素水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

從表2的極差R值可以看出：影響黃連生產(chǎn)副產(chǎn)物中黃連生物堿提取的主次因素為:A>B>C,即硫酸濃度>料液比>提取時(shí)間。方差分析結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 方差分析結(jié)果

由表4可知，硫酸濃度對(duì)黃連生物堿提取率有顯著影響，料液比、提取時(shí)間對(duì)黃連生物堿提取率無(wú)顯著影響，綜合上述各種因素，確定黃連生產(chǎn)副產(chǎn)物中黃連生物堿的最佳提取工藝條件為A3B2C2，即硫酸濃度為1.5%；料液比為1∶15；提取時(shí)間為1 h。

2.4.2 最佳提取工藝條件的驗(yàn)證 取重慶石柱縣產(chǎn)地的黃連須4份，按照單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總生物堿提取，平均提取率為3.089%(RSD=0.624%，n=4)。

3 討 論

分析研究結(jié)果表明：黃連葉生物堿含量很低，樁口(靠近黃連的葉柄)生物堿含量很高(表1)，表明樁口的藥用價(jià)值較高，而葉柄的利用價(jià)值較小，葉的利用價(jià)值也很小。黃連采收時(shí)，葉子和葉柄被剪下丟棄在田中，可見(jiàn)，丟棄在田中的葉子和葉柄沒(méi)有多少利用價(jià)值。

黃連植株在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)光照，生物堿逐漸向根莖運(yùn)輸，黃連須里生物堿也會(huì)由遠(yuǎn)離根莖的一端向根莖運(yùn)輸，沿著黃連須生長(zhǎng)方向，生物堿含量會(huì)逐漸減少，因此黃連須離黃連藥材較近的部分生物堿含量很高，尤其是黃連素含量更高，而離黃連藥材較遠(yuǎn)的部分黃連須生物堿含量相對(duì)較低(表1)。黃連在收獲時(shí)，連農(nóng)為了減輕運(yùn)輸量，通常將須根(實(shí)際上是離黃連藥材較遠(yuǎn)的部分)丟棄在田中，而離黃連藥材較近的部分隨黃連一起進(jìn)入下游加工，最后進(jìn)入“灰渣”?？梢?jiàn)。丟棄在田間的黃連須和葉柄等利用價(jià)值很小，黃連灰渣中的須根和柄(樁口)利用價(jià)值較高。黃連須目前在市場(chǎng)上的售價(jià)不到20元/kg，可利用其價(jià)格優(yōu)勢(shì)，在黃連短缺時(shí)可作為藥品生產(chǎn)企業(yè)和臨床合格的生產(chǎn)黃連生物堿替代品。另外，有研究提到[10]用乙醇回流加熱提取，作者經(jīng)過(guò)試驗(yàn)比較認(rèn)為：乙醇回流提取率工業(yè)生產(chǎn)成本高，在經(jīng)濟(jì)上不如用濃度為1.5%的硫酸提取合算。該提取工藝也為尋找黃連新藥用部位資源提供了理論基礎(chǔ)，使黃連生產(chǎn)副產(chǎn)物的大幅度開(kāi)發(fā)利用成為可能。

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