脫氧核苷酸鈉注射液聯(lián)合甘草酸二銨膠囊對(duì)人血白蛋白所致免疫性肝纖維化大鼠的影響

于首元 于兆安

（河南省南陽(yáng)市張仲景醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473000）

脫氧核苷酸鈉注射液聯(lián)合甘草酸二銨膠囊對(duì)人血白蛋白所致免疫性肝纖維化大鼠的影響

于首元 于兆安

（河南省南陽(yáng)市張仲景醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473000）

目的 觀察脫氧核苷酸鈉注射液（DNA注射液）聯(lián)合甘草酸二銨膠囊（甘利欣）對(duì)人血白蛋白（HSA）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化形成的影響。方法 采用HSA誘導(dǎo)大鼠肝纖維化并隨機(jī)分為DNA注射液聯(lián)合甘利欣組、甘利欣組、秋水仙堿組、模型組和對(duì)照組5組。觀察血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）含量、白蛋白和球蛋白比值（A/G），放射免疫分析法測(cè)定層連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、fn Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）的含量，化學(xué)法測(cè)定肝臟羥脯氨酸（HyP）的含量。光鏡觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和肝纖維化程度。結(jié)果 DNA注射液聯(lián)合甘利欣能明顯降低HSA誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠ALT，AST活性（P＜0.05，P＜0.01），提高Alb、TP含量及A/G比值（P＜0.05，P＜0.01），降低血清LN、HA、Ⅳ-C含量（P＜0.05，P＜0.01）。DNA注射液聯(lián)合甘利欣能使大鼠膠原纖維沉積明顯減輕，假小葉結(jié)構(gòu)顯著減少。結(jié)論 DNA注射液聯(lián)合甘利欣方可抑制HSA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化形成和發(fā)展，改善肝功能。

脫氧核甘酸鈉注射液；甘草酸二銨膠囊；白蛋白；肝纖維化；DNA注射液

肝纖維化發(fā)病率高，是大多數(shù)慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。如何防治肝纖維化是目前亟待解決的課題之一，我院2012年2月至2012年10月應(yīng)用脫氧核苷酸鈉注射液（DNA注射液）聯(lián)合甘利欣（甘利欣）對(duì)大鼠人血白蛋白（HSA）所致免疫性肝纖維化的影響作實(shí)驗(yàn)研究并探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

①動(dòng)物：Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量260～350 g，由鄭州大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。②藥物：DNA注射液（北京賽生藥物有限公司生產(chǎn)，哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)有限公司代理，規(guī)格：2 mL：50 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H11022106），甘草酸二胺膠囊（商品名：甘利欣，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥

取48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組。除正常對(duì)照組8只外，其余每組10只。參照文獻(xiàn)[1]制作大鼠免疫性肝纖維化模型。HSA（HSA廣東佰易藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）用0.9%氯化鈉注射液稀釋，與等量的不完全弗氏佐劑（美國(guó)sigma產(chǎn)品）完全乳化。除正常對(duì)照組外，每只大鼠皮下多點(diǎn)注射HSA稀釋液0.5 mL（含HSA 4 mg）共4次，前2次間隔14 d，后2次間隔l0 d。均由眼底靜脈叢取血，分離血清，用免疫擴(kuò)散法測(cè)定大鼠白蛋白抗體，待動(dòng)物血清出現(xiàn)白蛋白抗體后將大鼠隨機(jī)分為模型組，DNA注射液聯(lián)合甘利欣組（聯(lián)合用藥組）、甘草酸二胺膠囊組、秋水仙堿組。尾靜脈注射HSA，每周2次，第1周2.5毫克/只，每次0.5 mL，以后每次攻擊增加0.5 mg，直至4.5 mg，維持此量，共16次。正常對(duì)照組尾靜脈同時(shí)注射等容量0.9%氯化鈉注射液。在尾靜脈攻擊前1 d各組動(dòng)物給藥：DNA注射液（50 mg/kg）、甘利欣方高劑量組（50 mg/kg），秋水仙堿組（0.1 mg/kg，臨床用藥的12倍）。每日1次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組、模型組給予等體積的氯化鈉注射液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將大鼠用3.5%水合氯醛麻醉，取血，采血后頸椎脫臼除死大鼠，解剖取肝，放人10% PBS配制的甲醛液中固定。

表1 DNA注射射液聯(lián)合甘利欣對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT，AST，ALB，TP，A/G的影響（）

表1 DNA注射射液聯(lián)合甘利欣對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT，AST，ALB，TP，A/G的影響（）

注：與模型組相比1）P＜0.05，2）p＜0.01

分組 劑量(mg/kg) n AST(U/L) ALT(g/L) ALB(g/L) TP(g/L) A/G對(duì)照組 - 8 97.52±9.812) 36.75±5.262) 47.85±4.632) 64.86±8.952) 3.77±1.522)模型 - 8 146.28±12.95 73.13±6.40 35.33±3.41 53.15±3.85 1.85±0.45 DNA注射液 50 8 112.34±13.211) 68.73±5.10 43.87±2.12 55.56±4.75 3.57±2.241)聯(lián)合甘利欣甘利欣 50 8 105.07±12.32 2) 64.07±8.121) 44.40±4.742) 58.21±7.422) 3.13±1.522)秋水仙堿 0.1 7 104.11±15.101) 64.44±5.84 44.41±5.642) 57.16±6.172) 3.25±.1232)

表2 DNA注射液聯(lián)合甘利欣對(duì)大鼠血清Ⅳ-C，LN，HA的影響（）

表2 DNA注射液聯(lián)合甘利欣對(duì)大鼠血清Ⅳ-C，LN，HA的影響（）

注：與模型組相比1）P＜0.05，2）p＜0.01

分組 劑量(mg/kg) n Ⅳ-C(μg/L) IN(μg/L) HA(μg/mL) Hyp(μg/mg)對(duì)照 - 8 37.96±2.232) 46.68±15.872) 47.02±11.812) 0.75±0.252)模型 - 8 54.76±9.94 98.09±10.02 115,00±29.87 16.53±0.43 DNA注射液聯(lián)合甘利欣 50 8 43.95±6.351) 74.31±13.73 77.35±6.782) 1.26±0.341)甘利欣 50 8 43.16±2.942) 67.30±25.931) 51.10±12.512) 1.7±0.332)-2秋水仙堿 0.1 7 42.50±6.261) 74.42±22.85 96.7±29.352) 1.06±0.282)

1.2.2 觀測(cè)方法

①肝功能檢測(cè)：測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），血清總蛋白（TP），血清白蛋白（ALB），白蛋白和球蛋白比值（A/G）。②血清HA，LN和Ⅳ-C和肝臟Hyp的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書要求操作。③病理學(xué)觀察：取同一塊肝組織做病理切片檢察，常規(guī)HE染色，觀察肝組織學(xué)改變，Von Gieson（VG）膠原纖維顏色。肝纖維化按4級(jí)分[2]：0級(jí)（記0分）；I級(jí)（記1分）；Ⅱ級(jí)（記2分）：Ⅲ級(jí)（記3分）。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料用Ridit分析。采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)肝功能的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST活性明顯升高，血清ALB和TP明顯降低，A/G比值明顯倒置，提示HSA所致肝纖維化大鼠肝細(xì)胞明顯受到損害。給予秋水仙堿、DNA注射液聯(lián)合甘利欣、甘草酸二胺膠囊均能使AST，ALT顯著下降，ALB，TP，A/G均明顯升高，而聯(lián)合用藥組明顯好于單用甘草酸二胺膠囊組組，表明DNA注射液聯(lián)合甘草酸二胺膠囊有顯著保肝降酶作用（表1）。

2.2 對(duì)血清Ⅳ-C，LN，HA，Hyp的影響

模型組大鼠血清Ⅳ-C，LN，HA和Hyp明顯高于正常組，Ⅳ-C，LN，HA，Hyp含量增高，表明肝纖維化已經(jīng)形成。與模型組比較，秋水仙堿和聯(lián)合用藥組均顯著降低大鼠血清Ⅳ-C，LN，HA和Hyp的含量，表明DNA注射液聯(lián)合甘利欣對(duì)白蛋白所致肝纖維化大鼠有較好的治療作用（表2）。

3 討 論

肝炎病毒感染引起的肝纖維化與機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)，采用HSA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病理改變與病毒性肝炎相類似，更符合人慢性乙型肝炎肝纖維的形成機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSA所致免疫性肝纖維化大鼠均有明顯的肝損傷及慢性肝纖維化表現(xiàn)。DNA注射液聯(lián)合甘利欣應(yīng)用后對(duì)肝功能指標(biāo)均有不同程度的改善，對(duì)ALT、AST的抑制作用明顯。表明DNA注射液聯(lián)合甘利欣可明顯改善肝功能，具有保肝降酶作用，能使升高的HA、LN、Ⅳ-C、Hyp水平顯著降低。病理組織切片和VG染色結(jié)果表明，聯(lián)合用藥可使白蛋白所致免疫性肝纖維化大鼠肝纖維化程度明顯減輕，膠原纖維細(xì)胞和假小葉形成減少或界限模糊，表明DNA注射液聯(lián)合甘利欣能抑制膠原的合成和ECM的沉積，對(duì)白蛋白所致的肝損傷、慢性肝纖維化大鼠具有保護(hù)作用和抗肝纖維化作用。DNA注射液是一種復(fù)方制劑，其組分為脫氧核糖胞嘧啶核苷酸、脫氧核糖腺嘌呤核苷酸、脫氧核糖胸腺嘧啶核甘酸及脫氧核糖鳥嘌呤核苷酸鈉鹽。該藥是一種具有遺傳特性的化學(xué)物質(zhì)，與蛋白質(zhì)相結(jié)合成核蛋白，為生物體的基本物質(zhì)。它在個(gè)體的生長(zhǎng)、繁殖、遺傳、變異等生理生化功能方面起著重要作用，通過核糖核酸（RNA）控制蛋白質(zhì)的合成，尤其對(duì)某些關(guān)鍵性酶蛋白的合成，起協(xié)調(diào)體內(nèi)的一系列代謝作用。因此有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞活力的功能，以及改變機(jī)體代謝的作用。DNA注射液聯(lián)合甘利欣可以治HSA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化形成或發(fā)展，改善肝功能。提示DNA注射液聯(lián)合甘利欣能顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶活力對(duì)肝細(xì)胞壞死有一定的改善作用，具有較好的抗大鼠免疫性肝損傷作用，這與臨床應(yīng)用DNA注射液治療病毒性肝炎提供了一定的藥理學(xué)依據(jù)，是治療急慢性肝炎抗核酸代謝治療的代表藥物。

[1] 王寶恩,王志富,殷蔚黃,等.實(shí)驗(yàn)性免疫性肝纖維化模型的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1989,69(9):503.

[2] 韋艾凌.瘀痛消膠囊抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2002,29(7):446.

R657.3+1

：B

：1671-8194（2014）08-0037-02