血熱證銀屑病患者外周血Th1、Th2和Th17的表達(dá)

曹筱筱 徐 蓉 李福倫 王一飛 范 斌 李 峰 李 斌 陳 潔

血熱證銀屑病患者外周血Th1、Th2和Th17的表達(dá)

曹筱筱 徐 蓉 李福倫 王一飛 范 斌 李 峰 李 斌 陳 潔?

目的: 確定血熱證銀屑病患者Th1/Th2/Th17主要細(xì)胞因子與銀屑病血熱證候的相關(guān)性。方法: 分別采用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBCs)及血漿Th1/Th2/Th17細(xì)胞分泌主要細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果: 血熱證銀屑病的CD4＋I(xiàn)FN－γ為26.06±11.86較正常對(duì)照12.35±6.52升高(P＜0.05)；CD4＋I(xiàn)L－4＋及CD4＋I(xiàn)L－17＋較正常對(duì)照稍降低(P＞0.05)。IFN－γ為91.20±48.37較正常對(duì)照47.44±21.46升高，而IL－4較正常對(duì)照下降(P＜0.05)。IL－17的水平兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論: 血熱證銀屑病Th細(xì)胞免疫機(jī)制節(jié)點(diǎn)起主導(dǎo)作用的細(xì)胞亞型及細(xì)胞因子可能為Th1型，主導(dǎo)細(xì)胞因子為IFN－γ。

銀屑?。?血熱證； Th細(xì)胞

銀屑病是一種以皮膚的紅斑鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的常見(jiàn)慢性復(fù)發(fā)性疾病，病理表現(xiàn)為炎癥性表皮過(guò)度增生，發(fā)病率高。1銀屑病中醫(yī)稱之為“白疕”，認(rèn)為本病病位在血分，急性期多以血熱為主，壅于肌表而發(fā)，兼風(fēng)、寒、濕等因素；靜止期以血瘀為主，緩解期則以血虛為主。根據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為“血熱證、血瘀證、血虛證”三個(gè)證候，在疾病發(fā)展的過(guò)程中，各個(gè)證候可以相兼且有所側(cè)重，直至相互轉(zhuǎn)化。本課題分別檢測(cè)尋常型銀屑病血熱型患者Th細(xì)胞的3種細(xì)胞因子IFN－γ、IL－4、IL－17，且與正常對(duì)照組進(jìn)行比較。以明確尋常型銀屑病(PV)血熱型患者起主導(dǎo)作用的Th細(xì)胞類型及其細(xì)胞因子，繼而篩選PV血熱證侯分型的標(biāo)志性細(xì)胞因子。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2011年7月至2012年4月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科門診及病房有完整記錄的血熱證銀屑病患者30例，男19例，女11例；年齡20～65歲，平均46.36±13.04歲；其病情嚴(yán)重程度PASI評(píng)分為1.20～23.20分，平均10.35± 5.84分。正常對(duì)照為健康體檢者30名，其中男17名，女13名，年齡20～39歲，平均27.31±1.398歲。

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)2銀屑病進(jìn)行期:皮膚損害以紅色炎性丘疹、斑丘疹及大小不等的斑片為主，上覆多層銀白色鱗屑，刮除鱗屑可見(jiàn)一層光亮的薄膜，薄膜下有點(diǎn)狀出血(Auspitz征)。發(fā)病急，新疹多且不斷有新發(fā)疹出現(xiàn)，可見(jiàn)同形反應(yīng)(Koebner現(xiàn)象)。

中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)3血熱證:新皮疹不斷出現(xiàn)，以丘疹、斑丘疹為主，疹基底皮膚顏色鮮紅，刮去鱗屑見(jiàn)點(diǎn)狀出血，可有同形反應(yīng)。初發(fā)或復(fù)發(fā)，可有不同程度的瘙癢，心煩口渴或口干，便秘尿黃，舌質(zhì)紅，苔黃，脈數(shù)。

納入標(biāo)準(zhǔn):明確診斷為尋常型銀屑病血熱證；年齡18～65歲；病程0～20年；所選病例均為新發(fā)或最近3月未作任何治療，且無(wú)其他疾病史者。排除標(biāo)準(zhǔn):3個(gè)月內(nèi)曾采用系統(tǒng)治療，包括大面積外用強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑；合并有心、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病，精神病患者。

1.2 試劑和儀器 流式細(xì)胞儀檢測(cè)使用試劑及儀器:RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、淋巴細(xì)胞分離液均由PA公司提供；佛波酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；莫能霉素(monensin)、T細(xì)胞表面抗體:抗人CD4 PE、細(xì)胞因子抗體，抗人IFN－γ、FITC及抗人IL－4 PE－Cy7均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；流式細(xì)胞儀(MACSQuant SN2187)由德國(guó)Miltenyi公司生產(chǎn)。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法使用試劑及儀器:抗人IFN－γ、IL－4、IL－17A；ELISA試劑盒由西塘科技生物有限公司提供；酶標(biāo)儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)及洗板機(jī)(Wellwash 4 MK2)由芬蘭Thermo公司生產(chǎn)；具體步驟:參見(jiàn)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)。

1.3 方法 抽取患者及正常人外周靜脈血5 mL(肝素抗凝)；1000 r/min離心×5 min后取血漿－80℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)ELISA部分實(shí)驗(yàn)；采用密度梯度離心法分離單一核細(xì)胞(PBMCs)；取分離出PBMCs，5000 r/ min離心×5 min；去上清后再加磷酸緩沖液(PBS)，再次5000 r/min離心×5 min；吸棄上清，加250μL PBS重懸，200μL/孔PBMC細(xì)胞懸液鋪入96孔板加試劑(PMA 100 ng/m L，離子霉素1μg/mL，莫能霉素2 μmol/L)，刺激6 h后收細(xì)胞；300μL PBS，2000 r/min振蕩離心×5min；去上清后加50μL PBS，再加5μL CD4，孵育10 min后；加300μL PBS，2000 r/min振蕩離心×5 min；去上清加胞內(nèi)固定液500μL；30 min后再加500μL胞內(nèi)穿膜液離心2000 r/min×5 min；去上清加70μL胞內(nèi)穿膜液，分別加抗體IFN－γ、IL－4和IL－17A后振蕩過(guò)夜；加500μL胞內(nèi)穿膜液振蕩離心2000 r/min×5 min；去上清加300μL胞內(nèi)穿膜液上機(jī)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以ˉx±s表示，符合正態(tài)分布，則用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

見(jiàn)表1、2。從表可以看出血熱證銀屑病患者的CD4＋I(xiàn)FN－γ＋較正常對(duì)照升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD4＋I(xiàn)L－4＋及CD4＋I(xiàn)L－17＋較正常對(duì)照降低(P＞0.05)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿中IFN－γ較正常組有明顯升高(P＜0.05)，而血漿中IL－4較正常組下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿中IL－17較正常略有上升(P＞0.05)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

表2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法結(jié)果

3 討論

銀屑病病因病機(jī)比較復(fù)雜，幾千年以來(lái)中醫(yī)各家對(duì)銀屑病的辨證論治觀點(diǎn)各異，大部分的學(xué)者主張銀屑病從血分辨證為主，治療上也都從血入手，趙炳南4辨證分為3型:血熱證，血燥證，血瘀證。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，5尋常型銀屑病的發(fā)病機(jī)制與異常T細(xì)胞導(dǎo)致表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生有關(guān)。銀屑病的Th細(xì)胞主要向Th1及Th17方向分化，Treg起到微調(diào)上述分化的作用，而Th2則具有抑制上述分化趨向。6，7其中IFN－γ及IL－12促使Th向Th1分化并分泌IFN－γ、TNF－α等因子，Tbet是其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子；IL－4誘導(dǎo)Th向Th2分化進(jìn)而分泌IL－4、IL－5等因子，GATA3是其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子；IL－6、IL－23及TGF－β促使Th向Th17分化并分泌IL－6、IL－17及IL－22，RORγt是其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。8

通過(guò)本次研究可以發(fā)現(xiàn)，血熱證銀屑病患者血漿IFN－γ與外周血PBMCs中CD4＋I(xiàn)FN－ν＋均較正常組有明顯升高，兩者結(jié)果一致，表明血熱證銀屑病患者以Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位。而血熱證銀屑病患者外周血PBMCs中CD4＋I(xiàn)L－4＋、CD4＋I(xiàn)L－17＋與血漿IL－4、IL－17的改變與正常對(duì)照均無(wú)明顯差異。上述結(jié)果提示Th2及Th17細(xì)胞在血熱證銀屑病中不具有特殊的意義。

本課題通過(guò)兩種方法來(lái)檢測(cè)血熱證銀屑病患者3種Th細(xì)胞的代表性細(xì)胞因子IFN－γ、IL－4、IL－17，兩者的結(jié)果基本一致。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法其特異性不如流式細(xì)胞技術(shù)高，檢測(cè)的IFN－γ、IL－4、IL－17不僅僅由Th細(xì)胞分泌，其他細(xì)胞也會(huì)少量的分泌，但是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的結(jié)果可以對(duì)血熱證銀屑病做一個(gè)大致的判斷。

本研究檢測(cè)的三類Th細(xì)胞及其細(xì)胞因子只是針對(duì)于血熱證銀屑病患者，其與正常對(duì)照比較，初步發(fā)現(xiàn)了此類型的患者Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達(dá)較其他Th細(xì)胞比較占明顯的主導(dǎo)地位。但是對(duì)于血熱證銀屑病患者與其他證型的銀屑病患者在此三類Th細(xì)胞及其細(xì)胞因子之間是否有差異，有待于進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

1Blauvelt A，Bichenbach JR，Dulesz－Martin MF，et al.Montagna symposium 2008:the biologic basis of posriasis.J Invest Dermatol，2009，129(2):259－260.

2趙辨.臨床皮膚病學(xué).3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2001. 759－772.

3上海市衛(wèi)生局.上海市中醫(yī)病癥診療常規(guī).2版.上海:上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，2005.231－234.

4趙炳南，張志禮.簡(jiǎn)明中醫(yī)皮膚病學(xué).北京:中國(guó)展望出版社，1983.9:200－203.

5Oritz A，Yamauchi PS.A treatment strategy for psoriasis transitioning from systemic therapy to biologic agents.Skinmed，2006，5(6):285－288.

6Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al.Interleukin 17－producing CD4＋effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.Nat Immunol，2005，6 (11):1123－1132.

7 Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4 cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.Nat Immunol，2005，6(11):1133－1141.

8Weaver CT，Harrington LE，Mangan PR，et al.Th17:an effector CD4T cell lineage with regulatory T cell ties.Immunity，2006，24:277－688.

(收稿:2013－10－30)

The expression of Th1/Th2/Th17 in peripheralblood of the patientsw ith b lood－h(huán)eat syndrome of psoriasis

CAO Xiao-xiao，XU Rong，LIFu-lun，et al.Yueyang Hospital of Integrative Chinese＆Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，200437

Objective:To determ ine the association between Th1/Th2/Th17 cytokines，and blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis.Methods:Flow cytometry and ELISA were applied to test Th1/Th2/Th17 cytokines in the peripheral blood of the patientswith blood－h(huán)eatsyndrome of psoriasis and healthy controls.Results:CD4＋I(xiàn)FN－γ＋was higher in the patients with blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis than in the healthy controls，with a significant difference between the two groups(P＜0.05)，but the level of CD4＋I(xiàn)L－4＋and CD4＋I(xiàn)L－17＋was lower than healthy controls(P＞0.05).The level of IFN－γwas higher in the patients with blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis than in healthy controls.The level of IL－4 was lower in the patientswith blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis than in controls(P＜0.05).There was no significant difference in the level of IL－17 between the two groups(P＞0.05).Conclusion:Themajor Th cell immunemechanism in blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis was Th1 cell and themajor cytokineswas IFN－γ.

psoriasis；blood heat syndrome；Th cells

上海市自然基金(編號(hào):11ZR1438000)

上海市高級(jí)中西醫(yī)結(jié)合人才培養(yǎng)計(jì)劃(編號(hào):ZYSNXD012－RC－ZXY010)

上海市衛(wèi)生局項(xiàng)目(編號(hào):2011XY004)

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科，上海，200437

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